Параметры лада гранта: Шины и диски для Lada Granta, размер колёс на Лада Гранта

Сравнение значений K _d , полученных с помощью двух подходов по тушенной эмиссии донора или эмиссии акцептора. ( A ) K _d сравнивали значения, определенные либо гашением FRET, либо эмиссией при различных концентрациях CyPet-SUMO1. ( B ) K _d значений после глобальной оптимизации либо тушения FRET, либо наборов данных по выбросам.( C ) Анализ начальной загрузки обоих значений K _d не выявил значительной разницы.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — Chemistry LibreTexts

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это специальный метод измерения расстояния между двумя хромофорами, называемый парой донор-акцептор. Ограничение FRET состоит в том, что этот процесс переноса эффективен только тогда, когда расстояние между донорно-акцепторной парой меньше 10 нанометров.Однако FRET — это явление, сильно зависящее от расстояния, и поэтому он стал популярным инструментом для измерения динамической активности биологических молекул в наномасштабе.

Введение

FRET — это аббревиатура от Förster (флуоресценция) резонансной передачи энергии. Передача энергии по Фёрстеру — это явление, при котором возбужденный донор передает энергию (не электрон) акцепторной группе посредством безызлучательного процесса. Этот процесс сильно зависит от расстояния, что позволяет исследовать биологические структуры.Одним из распространенных приложений является простое измерение расстояния между двумя интересующими позициями на большой молекуле, обычно биологической макромолекуле, путем присоединения соответствующих донорно-акцепторных групп к большой молекуле. Если большая молекула включает только одного донора и одну акцепторную группу, расстояние между донором и акцептором можно легко измерить, если в этом процессе нет конформационных изменений. Кроме того, если молекула имеет огромное конформационное изменение, можно также измерить динамическую активность между двумя сайтами на этой макромолекуле, например, взаимодействия белков.Сегодня этот метод широко применяется во многих областях, таких как эксперименты с одиночными молекулами, молекулярные двигатели, биосенсоры и механические движения ДНК. FRET также называют «спектроскопической линейкой» из-за его внутреннего удобства.

Общая картина FRET

Теоретический анализ был хорошо разработан Теодором Ферстером. Этот механизм безызлучательного переноса схематически представлен на рисунке 1. Донорная группа (D) возбуждается фотоном, а затем релаксирует в самое низкое возбужденное синглетное состояние, S ₁ (по правилу Каша).Если акцепторная группа находится не слишком далеко, энергия, выделяемая при возвращении электрона в основное состояние (S ₀ ), может одновременно возбуждать донорную группу. Этот безызлучательный процесс называется «резонансом». После возбуждения возбужденный акцептор излучает фотон и возвращается в основное состояние, если другие состояния тушения не существуют.

Резонансный механизм связан с кулоновским взаимодействием между электронами.Таким образом, относительное расстояние кулоновского взаимодействия между парой донор-акцептор может быть больше, чем передача энергии электронного обмена, которая требует перекрытия волновых функций, а именно передачи энергии Декстера. Кулоновское взаимодействие требует только перекрытия спектра, что означает идентичность резонансной энергии. Рисунок 2 здесь дает представление о том, что такое резонансный механизм. (Обратите внимание, что зазор HOMO-LUMO не равен разности энергий между основным состоянием и самым низким возбужденным состоянием молекулы S ₁ .)

Факторы, влияющие на FRET

Эффективность FRET (\ (E \)) — квантовый выход перехода с переносом энергии; то есть доля события передачи энергии, приходящейся на событие возбуждения донора ^. Эффективность FRET определяется по

\ [\ E = \ dfrac {k_ {ET}} {k_f + k_ {ET} + \ sum k_i} \ tag {1} \]

где

• \ (k_ {ET} \) — скорость FRET
• \ (k_f \) — скорость радиационной релаксации (т.е.6} \ tag {2} \]

  где

  • \ (r \) — расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а
  • \ (R_o \) — характерное расстояние (расстояние Ферстера или радиус Ферстера) с эффективностью передачи 50%

  Перекрытие спектра

  Чтобы повысить эффективность FRET, группа доноров должна иметь хорошие способности поглощать фотоны и излучать фотоны. 4 d \ lambda \ tag {3} \],

  где

  • F _D (λ) — нормированный спектр излучения донора
  • \ (\ epsilon_ {A} «)}} стандартов для молярного коэффициента поглощения акцептора и
  • λ — длина волны.

  Ориентация переходных диполей

  На механизм резонансной передачи энергии также влияют ориентации диполя эмиссионного перехода донора и диполя поглощения акцептора. Параметр ориентации κ ² дает количественное значение взаимодействия между двумя дипольными моментами. κ ² теоретически может принимать значения от 0 (когда диполи перпендикулярны друг другу) до 4 (когда диполи коллинеарны). κ ² равно 1, когда эти два переходных диполя параллельны.Ориентация переходных диполей показана на Рис. 4. Для свободно вращающейся группы доноров и акцепторов среднее значение κ ² обрабатывается как 2/3.

  Расстояние Фёрстера (R

  ₀ ) Длинный R ₀ может привести к высокой эффективности FRET. Основываясь на анализе Ферстера, R ₀ является функцией квантового выхода донорного хромофора \ (\ Phi_ {D} \), спектрального перекрытия донора и акцептора J (λ), направленности переходных диполей κ ² и показатель преломления среды \ (п \).{-4} \ tag {4} \]

  Таблица 1: Расстояния Ферстера различных донорно-акцепторных пар.

  Донор	Приемник	Расстояние Фёрстера (R0, нм)
  Нафталин	Дансил	2,2
  LY	TNP-ATP	3,5
  Дансил	ODR	4.3
  LY	EM	5,3
  FITC	EM	6.0
  BPE	CY5	7,2
  Сокращения: BPE , B-фикоэритрин; CY5 , карбоксиметилиндоцианин; Dansyl , просто дансильная группа; EM , малеимид эозина; FITC , фторцеин-5-изотиоцианат; LY , желтый Люцифер; ODR , октадецилродамин; TNP-ATP , тринитрофенил-ATP.

  Заключение и ограничения FRET

  FRET обеспечивает эффективный способ измерения расстояния между донорным и акцепторным хромофором. На эффективность передачи энергии сильно влияет соотношение R и R ₀ из-за экспоненты 6. Таким образом, измеряя эффективность FRET, можно легко получить точное расстояние между донором и акцептором. При правильном выборе донора и акцептора этот эксперимент также можно провести in vivo .Однако FRET дает информацию только о расстояниях. Если происходит резкое конформационное изменение, такое как удлинение или изгиб, невозможно узнать точное движение донора и акцептора. Кроме того, прикрепление хромофоров к точным участкам макромолекулы также важно, как по количеству хромофоров, так и по положению макромолекулы, иначе FRET может создавать шумовые сигналы. (См. Вопрос 5)

  Внешние ссылки

  1. Онлайн-лекция профессора Пола Р.Селвин, профессор физики UIUC. Лекция охватила все фундаментальные аспекты FRET и объяснила классические эксперименты, связанные с FRET. http://nanohub.org/resources/4333

  2. Первая серия международных лекций Теодора Ферстера в Кембриджском университете. Серия содержит вопросы, относящиеся к фундаментальным знаниям о современных приложениях. Кембриджский университет записал все лекции и загрузил их на сайт. laser.ceb.cam.ac.uk/foerster/

  Проблемы

  Вопрос 1

  Нить F-актина состоит из мономеров G-актина.Прикрепив хоромофор донора (D) или акцептора (A) к мономеру G-актина и измерив эффективность передачи энергии, чтобы измерить среднее расстояние между мономерами G-актина в филаменте F-актина (при условии, что мономеры в норме расположены в последовательности DADADADA ….), и обнаруживается, что средняя эффективность передачи энергии составляет 23%. Если R ₀ составляет 4,5 нм, каково среднее расстояние между мономерами в нити? (Вопросы 1 и 2 отредактированы из интересной статьи, которая визуализировала равновесие F-актина и G-актина с помощью техники FRET.

  ⁹

  )

  Вопрос 2

  На основании вопроса 1, если последовательность филамента состоит из 8 мономеров в порядке DADADADA, сколько видов эффективности может быть обнаружено, если филамент не изгибается, а R ₀ достаточно велик, чтобы увидеть их все. ?

  Вопрос 3

  Пара cy3-дорнор и cy5-акцептор прикреплена к финалам последовательности ДНК.Если игнорировать ориентацию переходных диполей донора и акцептора, нарисуйте зависимость между отношением (R / R _{0 )} и эффективностью передачи энергии.

  Вопрос 4

  Воспользуйтесь примером из вопроса 3, а теперь рассмотрите ориентацию переходных диполей. Постройте зависимость между разделяющим расстоянием донорно-акцепторной пары и эффективностью передачи энергии. (Помните, что при удлинении ДНК путем добавления пар оснований ориентация донорных и акцепторных хромофоров изменится) (Вопросы 3 и 4 переработаны из статьи, в которой измерялась ориентационная зависимость в процессе FRET с использованием спирали ДНК.

  ¹⁰

  )

  Вопрос 5

  Одна из наиболее сложных проблем в области ионных каналов — это наблюдение за тем, как канал работает in vivo и за конформационным изменением канала, который встроен в клеточную мембрану. Если ученый хочет исследовать движение ворот ионного канала с помощью FRET, какие факторы следует учитывать? Например, как правильно привязать донор и акцептор к точным позициям затвора канала.(Вопрос 5 переработан из этого документа

  ¹¹

  .)

  Ключи

  1. 5,5 нм.
  2. Будет обнаружено 4 вида эффективности.
  3. См. Веб-сайт профессора Тэкджип Ха. Https://netfiles.uiuc.edu/tjha/www/newTechnique.html
  4. См. PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / pnas.0801707105
  5. Открытый вопрос. Пожалуйста, обратитесь к этой вводной статье об использовании FRET для исследования движений ионных каналов.Биофизический журнал, 2003 г., январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9

  Сноски

  1. PNAS, декабрь 2006 г., 103 (49), 18458-18463, DOI: 10.1073 / pnas.0605422103
  2. PNAS, ноябрь 2008 г., 105 (47), 18337-18342, DOI: 10.1073 / pnas.0800977105
  3. Nature Biotechnology 2003, 21, 1387-1395, DOI: 10.1038 / nbt896
  4. PNAS, октябрь 2009 г., 106 (42), 17741-17746, DOI: 10.1073 / pnas.0
     7106
  5. Nature, 1997 августа, 388, 882-887
  6. PNAS, декабрь 2006 г., 103 (51) 19217-19218, DOI: 10.1073 / pnas.0609223103
  7. PNAS, август 1967 г., 58 (2), 719-26. DOI: 10.1073 / pnas.58.2.719
  8. Аналитическая биохимия, апрель 1994 г., 218 (1), 1-13, DOI: 10.1006 / abio.1994.1134
  9. Протоколы природы, 2006 г., 1 августа, 911–919, DOI: 10.1038 / nprot.2006.122
  10. PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / pnas.0801707105
  11. Биофизический журнал, 2003, январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9

  FRET-меченных миРНК зондов для отслеживания сборки и разборки миРНК-нанокомплексов

  dc.участник. автор	Алаби, Кристофер А.
  dc.contributor.author	Любовь, Кевин Т.
  dc.contributor.author	Sahay, Gaurav
  dc.contributor.author	Stutzman, Tina M.
  dc.contributor.author	Янг, Уитни Т.
  dc.contributor.author	Лангер, Роберт
  постоянного тока.участник. автор	Андерсон, Дэниел Гриффит
  dc.date.accessioned	2013-07-02T16: 15: 16Z
  dc.date.available	2013-07-02T16: 15: 16Z
  dc.date.issued	2012-06
  dc.date.subloaded	2012-03
  dc.identifier.issn	1936-0851
  идентификатор постоянного тока.ISSN	1936-086X
  dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/1721.1/79407
  dc.description.abstract	Сборка, стабильность и своевременная разборка нанокомплексов коротких интерферирующих РНК (миРНК) могут влиять на эффективность доставки миРНК и сайленсинга генов. Таким образом, разработка новых зондов, которые могут измерять эти свойства без значительного нарушения нанокомплексов или их среды, может облегчить изучение и дальнейшую разработку новых нанокомплексов siRNA.Здесь мы изучаем зонды siRNA, меченные Förster-резонансным переносом энергии (FRET), которые могут отслеживать сборку, стабильность и разборку нанокомплексов siRNA в различных средах. Зонд состоит из двух идентичных миРНК, каждая из которых помечена флуорофором. При образовании нанокомплекса связанные с миРНК флуорофоры локально агрегируются внутри нанокомплекса и подвергаются FRET. Ключевым преимуществом этого метода является то, что средство доставки (DV) не нужно маркировать, что позволяет характеризовать большое количество наноносителей, некоторые из которых может быть трудно или даже невозможно маркировать.Мы демонстрируем доказательство концепции путем измерения сборки различных DV с миРНК и демонстрируем хорошее согласие с экспериментами по гель-электрофорезу. Благодаря тому, что не нужно маркировать DV, мы можем определять биофизические параметры нанокомплекса, такие как кажущиеся константы внеклеточной диссоциации (KD) и период полураспада внутриклеточной разборки для нескольких собственных и запатентованных коммерческих DVs. Более того, отсутствие модификации DV делает возможным истинное прямое сравнение между DV, а также корреляцию между их биофизическими свойствами и подавлением генов.	ru_US
  dc.description.sponsorship	Национальные институты здравоохранения (США) (грант NIH R37-EB000244)	ru_US
  dc.description.sponsorship	Национальные институты здравоохранения (США) (грант NIH R01-CA132091)	ru_US
  dc.description.sponsorship	Национальные институты здравоохранения (США) (грант NIH R01-CA115527)	ru_US
  dc. описание.спонсорство	Национальные институты здравоохранения (США) (постдокторантура)	ru_US
  dc.language.iso	ru_US
  dc.publisher	Американское химическое общество	ru_US
  dc.relation.isversionof	http://dx.doi.org/10.1021/nn3013838	en_US
  dc.rights	Статья доступна в соответствии с политикой издателя и может подпадать под действие закона США об авторском праве.Пожалуйста, обратитесь к сайту издателя, чтобы узнать условия использования.	ru_US
  источник постоянного тока	Christopher Alabi	ru_US
  dc.title	FRET-меченные siRNA зонды для отслеживания сборки и разборки siRNA-нанокомплексов	ru_US
  постоянного тока тип	Артикул	ru_US
  dc.identifier.citation	Alabi, Christopher A., ​​Kevin T. Love, Gaurav Sahay, Tina Stutzman, Whitney T.Янг, Роберт Лангер и Дэниел Г. Андерсон. Зонды миРНК, меченные FRET, для отслеживания сборки и разборки нанокомплексов миРНК. САУ Нано 6, вып. 7 (24 июля 2012 г.): 6133-6141.	ru_US
  dc.contributor.department	Институт интегративных исследований рака Дэвида Х. Коха при Массачусетском технологическом институте	ru_US
  dc.contributor.department	Harvard University — MIT Division of Health Sciences and Technology	ru_US
  постоянного тока.Contributor.department	Массачусетский технологический институт. Департамент биологической инженерии	ru_US
  dc.contributor.department	Массачусетский технологический институт. Кафедра химического машиностроения	ru_US
  dc.contributor.approver	Alabi, Christopher Akinleye	ru_US
  dc.contributor.mitauthor	Алаби, Кристофер А.	ru_US
  постоянного тока.Contributor.mitauthor	Любовь, Кевин Т.	ru_US
  dc.contributor.mitauthor	Sahay, Gaurav	ru_US
  dc.contributor.mitauthor	Stutzman, Tina M.	ru_US
  dc.contributor.mitauthor	Лангер, Роберт	ru_US
  dc.contributor.mitauthor	Андерсон, Дэниел Гриффит	ru_US
  постоянного тока.Relations.journal	ACS Nano	ru_US
  dc.eprint.version	Последняя рукопись автора	en_US
  dc.type.uri	http://purl.org/eprint/type/JournalArticle	en_US
  eprint.status	http://purl.org/eprint/status/PeerReviewed	en_US
  dspace.orderedauthors	Alabi, Christopher A .; С любовью, Кевин Т .; Сахай, Гаурав; Штуцман, Тина; Янг, Уитни Т.; Лангер, Роберт; Андерсон, Дэниел Г.	ru_US
  dc.identifier.orcid	https://orcid.org/0000-0002-2100-1171
  dc.identifier.orcid	https://orcid.org/0000-0001-5629-4798
  dc.identifier.orcid	https://orcid.org/0000-0003-4255-0492
  dspace.mitauthor.error	true
  mit.license	PUBLISHER_POLICY	ru_US

  Фёрстеровская микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET)

  00:00:12.06 На этом семинаре я собираюсь подробнее рассказать о том, как изобразить
  00: 00: 15.10 молекулярные взаимодействия в клетках с помощью флуоресценции
  00: 00: 18.22 резонансной передачи энергии. Таким образом, этот семинар организован следующим образом:
  00: 00: 24.00. Я начну с принципов резонансной передачи энергии флуоресценции
  00: 00: 27.06. Затем я рассмотрю соответствующие параметры
  00: 00: 30.24, которые важно понимать для измерения конкретных молекулярных взаимодействий
  00: 00: 34.08. Я собираюсь вскоре обсудить
  00:00:39.08 хороших пар флуоресцентных белков для измерения передачи энергии
  00: 00: 43.03 для каждого взаимодействия. А затем я собираюсь обсудить подходы
  00: 00: 47.28 для реального изображения FRET с помощью микроскопа. И здесь есть особый порядок
  00: 00: 52.00, где я начинаю с наименее количественного,
  00: 00: 55.05, но самый простой способ измерения, и по мере продвижения он становится
  00: 00: 58.09 усложняется, поскольку мы получаем больше количественной информации
  00: 01: 00.21 о молекулярных взаимодействиях в клетках.
  00: 01: 03.08 Итак, идея использования флуоресцентного резонансного переноса энергии
  00: 01: 07.07 для измерения молекулярных взаимодействий основана на обнаружении
  00: 01: 11.02 совпадений молекул. Обычно то, что вы делаете, когда хотите
  00: 01: 17.09 обнаруживать взаимодействия молекул, скажем, в биохимическом эксперименте
  00: 01: 19.25, вы опускаете одну из молекул и смотрите, что выходит
  00: 01: 23.15 вниз. Так что это своего рода прямая мера взаимодействия.
  00: 01: 26.02 В этом случае мы в основном смотрим на взаимодействие, предполагающее взаимодействие
  00:01:29.26 случайно в космосе. Теперь это можно сделать с помощью микроскопа.
  00: 01: 33.27 Проблема с обычным широкопольным микроскопом в том, что
  00: 01: 38.29 в каком-то смысле дифракционные пределы являются наблюдаемыми элементами.
  00: 01: 42.23 Таким образом, типичный элемент объема, который вы можете разрешить с помощью широкоугольного микроскопа
  00: 01: 46.12, имеет порядок фемтометра, что соответствует
  00: 01: 49.23 приблизительно в микронном кубе. Конечно, сущности, которые мы обнаруживаем
  00: 01: 54.13, или сущности, которые мы хотим знать, взаимодействуют ли они с
  00:01:56.-22. Таким образом, мы имеем
  00: 02: 04.21 разницы на несколько порядков в этих масштабах. Теперь вы можете использовать колокализацию
  00: 02: 09.09, чтобы сделать вывод о взаимодействии, но вероятность того, что у вас есть
  00: 02: 13.28 взаимодействие, когда вы видите колокализацию, очень мала.
  00: 02: 17.09 Итак, как мы можем его улучшить и как мы можем использовать FRET
  00: 02: 19.17, чтобы на самом деле уменьшить этот объем обнаружения?
  00: 02: 23.17 Итак, сначала позвольте мне обсудить, что такое FRET на самом деле.
  00: 02: 27.16 Итак, резонансный перенос энергии флуоресценции является безызлучательным
  00:02:31.08 передачи, и слово «безызлучательный» имеет важное значение. Это не
  00: 02: 34.13 банальное излучение фотона, а реабсорбция акцептором.
  00: 02: 39.18 Это диполь-дипольный механизм связи. Итак, это
  00: 02: 42.26 безызлучательный перенос энергии между ближайшими флуорофорами.
  00: 02: 45.16 Теперь, если вы обычно возбуждаете донора, скажем, синим светом,
  00: 02: 50.08 в данном случае это GFP. Он очень быстро релаксирует из высоко возбужденного состояния
  00: 02: 54.26 за счет взаимного преобразования или препаративной релаксации к первому электрону
  00:02:59.05 возбужденное состояние. Оттуда он может делать несколько вещей, он может вернуться в основное состояние
  00: 03: 03.03 путем взаимного преобразования безызлучательного распада. Или
  00: 03: 07.02 он может испускать фотон. Если у вас есть связь с акцептором,
  00: 03: 13.03 диполь-дипольная связь, то у вас есть дополнительный канал
  00: 03: 16.14 безызлучательного распада с более короткими временами жизни состояний. Это означает, что
  00: 03: 22.06 акцептор — извините, донор, на самом деле будет излучать меньше света.
  00: 03: 25.20 Таким образом, вы получаете тушение донора, когда происходит FRET.
  00: 03: 29.03 В то же время акцептор возбуждается этим процессом.
  00: 03: 34.21 Опять же, это не поглощение фотона, это диполь-дипольная связь
  00: 03: 38.06, и он возбуждается, а затем начинает излучать флуоресценцию.
  00: 03: 41.23 Итак, вы получаете в основном излучение от акцептора
  00: 03: 46.23 из-за этого процесса. Итак, что мы делаем, так это то, что мы не можем напрямую измерить FRET
  00: 03: 51.04, это не прямое наблюдение, но мы можем
  00: 03: 55.06 вывести FRET по изменению фотофизических свойств
  00:03:58.22 или эмиссия донора или акцептора. Итак, вот
  00: 04: 05.04 несколько важных параметров, которые вы можете использовать для количественной оценки FRET. Один из них — фактически эффективность FRET. А эффективность FRET
  00: 04: 15.22 — это, по сути, количество возбужденных доноров, передающих
  00: 04: 19.21 энергии акцептору, деленное на количество фотонов
  00: 04: 24.01, поглощенных донором. Это, конечно, количество
  00: 04: 29.29 возбужденных доноров. Так что это в основном часть доноров, которые
  00:04:34.13 передают энергию акцептору. Вы также можете указать это на языке скоростей
  00: 04: 39.04, это скорости передачи в секундах минус единица.
  00: 04: 42.21 Итак, здесь мы имеем в основном соотношение между скоростью передачи
  00: 04: 46,22, деленной на общую скорость возбуждения донора.
  00: 04: 51.29 Это скорость переноса, плюс сумма
  00: 04: 55.20 безызлучательного распада до основного состояния и
  00: 04: 57.24 радиационного распада в основное состояние или перехода в основное состояние. земля
  00:05:00.19 состояние. Эффективность может быть равна этому соотношению
  00: 05: 06.06, где вы видите два параметра. Один — это радиус Форстера,
  00: 05: 12.16 или ноль — это важный параметр, он представляет расстояние
  00: 05: 16.23, на котором эффективность составляет 50%, поэтому половина возбужденного донора
  00: 05: 20.03 молекулы переходят к акцептору. Обычно это порядка
  00: 05: 23,28 нанометров. Таким образом, вы получаете этот процесс в нанометровом диапазоне.
  00: 05: 29.18 Он также появляется здесь, и здесь у нас в основном расстояние
  00:05:33.6, что делает ее очень крутой.
  00: 05: 40.10 Таким образом, эффективность — это способ измерения расстояний между донором и акцептором
  00: 05: 46.24. Итак, здесь я построил график эффективности FRET
  00: 05: 53.03 как функцию расстояния между донором и акцептором
  00: 05: 56.06 в единицах радиуса Форстера. Итак, если у вас есть радиус Форстера
  00: 06: 00.18 или радиус 1, то здесь у вас должен быть показан 50% -ный перенос энергии.
  00: 06: 06.14 Дело в следующем, если у вас есть молекулы, которые не
  00:06:12.05 взаимодействуют в растворе, среднее расстояние настолько велико, что вы не можете получить передачу энергии
  00: 06: 17.24. В качестве примера: если у вас 1 микромолярный раствор
  00: 06: 21.05, среднее расстояние между молекулами
  00: 06: 24.07 составляет порядка 100 нанометров, что составляет примерно
  00: 06: 27.21 20 единиц. по этой шкале, которая находится далеко вправо.
  00: 06: 31.06 Значит, вы не получите передачи энергии. Однако, если вы перейдете к концентрации
  00: 06: 35.02 в 1 миллимолярный, среднее расстояние станет примерно
  00:06:38.02 как 10 нанометров, и мы приближаемся к этой точке по сравнению с
  00: 06: 41.14 здесь. Однако, когда мы экспрессируем белки в клетках, мы имеем
  00: 06: 46,13, как правило, порядка 1-10 микромолярной концентрации,
  00: 06: 50,21, и в растворе это не должно быть проблемой. Итак, мы отсюда
  00: 06: 53.12, так что у нас нет этого тривиального процесса FRET.
  00: 06: 56.08 Это связано с концентрацией и средними молекулами.
  00: 06: 59.26 Из-за сильной зависимости от расстояния у вас в основном
  00:07:04.08 ситуация, когда никакое взаимодействие не дает вам FRET,
  00: 07: 06.16 и взаимодействующие молекулы дают вам FRET. Итак, это наши параметры
  00: 07: 14.18, которые определяют наш ноль. А здесь первый коэффициент
  00: 07: 20.13, называемый квадратом каппа, на самом деле является геометрическим фактором.
  00: 07: 25.15 Он определяется ориентацией переходных моментов
  00: 07: 29.23, которые являются диполями перехода. Когда две молекулы имеют совмещенные моменты перехода
  00: 07: 34.14, процесс передачи становится
  00:07:40.04 очень эффективны, они имеют коэффициент 4. Однако, когда они
  00: 07: 43.19 перпендикулярны, этот коэффициент в основном равен 0. Таким образом, вы можете иметь ситуацию
  00: 07: 47.08, когда два хромофора кажутся проксимальными, но они находятся в
  00: 07: 52.00 под прямым углом к ​​моментам перехода, так что вы не получите FRET.
  00: 07: 53.21 В общем, этот коэффициент заявлен как 2/3, где вы в основном
  00: 08: 01.17 усредняете по всем ориентациям. Это означает очень гибкие флуорофоры
  00:08:04.02, которые движутся во всех направлениях. Обычно во время передачи,
  00: 08: 07.09 вы пробуете все ориентации. Можно показать, что этот коэффициент
  00: 08: 11.26 равен 2/3. К сожалению, для флуоресцентных белков хромофоры
  00: 08: 17.27 встроены в цилиндр и являются довольно жесткими. А переориентация
  00: 08: 21.04 ствола довольно медленная по временной шкале переноса.
  00: 08: 24.29 Это означает, что на самом деле мы не можем сделать это динамическое усреднение
  00: 08: 28.19 для такого статического усреднения, которое мы получаем.Таким образом,
  00: 08: 32.14 представляет собой проблему, которая фактически помешает нам использовать эффективность
  00: 08: 36.19 для вычисления расстояния между молекулами.
  00: 08: 41.01 Однако все же изменение эффективности в комплексе сообщит нам
  00: 08: 45.08, если, например, происходит конформационное изменение.
  00: 08: 48.21 Если вы поместите это в 2/3, мы действительно сможем сравнить различные пары флуоресцентных белков
  00: 08: 55.09 с точки зрения эффективности переноса.
  00:08:58.03 Я просто делаю это постоянным. Второй параметр здесь — это показатель преломления
  00: 09: 04,24, который, скажем, для цитоплазмы установлен на 1,4.
  00: 09: 09.16 Так что это более или менее константа, мы не слишком беспокоимся о
  00: 09: 12.03. Этот множитель является интегралом перекрытия.
  00: 09: 19.22 Что представляет собой принцип резонанса, который перекрывает
  00: 09: 25.01 испускание донора и поглощение акцептора.
  00: 09: 30.20 В нем указано, насколько совпадают фактические уровни энергии.Чем больше совпадений
  00: 09: 34.18, тем лучше вы получите перевод. И он определяется этим интегралом
  00: 09: 39.02, показанным здесь, который снова показывает спектр излучения,
  00: 09: 41.24 спектр поглощения. Итак, здесь необходимо учитывать две вещи:
  00: 09: 47.28 коэффициент экстинкции акцептора является важным параметром
  00: 09: 53.25. Чем он выше, тем эффективнее перевод.
  00: 09: 56.20 Итак, вы хотите иметь молекулы с высокой экстинкцией
  00:10:01.05, чтобы увеличить ваш R0. Он представляет способность
  00: 10: 05.20 молекулы поглощать фотоны. Другой важный фактор для
  00: 10: 09.29 — это лямбда до 4-го числа. Таким образом, интеграл перекрытия
  00: 10: 14.06 становится выше, когда вы переходите к красной части спектра
  00: 10: 17.21, что означает, когда вы используете флуоресцентные белки
  00: 10: 20.02, которые больше в В красной части спектра перекрытие интеграла
  00: 10: 23.03 становится больше. И вы получите R0 побольше.
  00: 10: 28.21 Приведенные здесь квантовые выходы — квантовый выход донора.
  00: 10: 35.17 Чем больше фотонов может быть испущено донором
  00: 10: 39.09, когда он находится в возбужденном состоянии, тем лучше будет процесс передачи.
  00: 10: 41.29 И это может быть максимум 1. Итак, вот некоторые значения R0
  00: 10: 47.12, которые я сделал для нескольких флуоресцентных белков, доступных на данный момент
  00: 10: 51.26. И я начал с представления R0
  00: 10: 55.28 для классической пары, голубого флуоресцентного белка и желтого
  00:10:59.17 флуоресцентный белок. Эта пара часто использовалась в прошлом, потому что
  00: 11: 02.29 у нас не было выбора для других пар флуоресцентных белков.
  00: 11: 06.11 R0 довольно умеренный, поэтому он близок к 5 нм, но в настоящее время
  00: 11: 12.08, поскольку у нас может быть больше флуорофоров, излучающих красный, мы можем
  00: 11: 16.09 фактически увеличить R0 до лучшего обнаруживать взаимодействия.
  00: 11: 19.03 Кроме того, у нас есть лучшие голубые флуоресцентные белки, например,
  00: 11: 23.14, которые увеличивают квантовый выход, один из параметров, который был
  00:11:25.24 важны для нашего R0, а значит, увеличивают R0.
  00: 11: 29.06 Так, например, этот церулеан является вариантом голубого флуоресцентного белка
  00: 11: 32.26 с акцепторным цитрином, который представляет собой вариант желтого флуоресцентного белка
  00: 11: 35.13, уже имеющий R0 из 5.3. Теперь, если мы используем,
  00: 11: 40.24, например, mCitrine в качестве донора вместо акцептора,
  00: 11: 44.05 у нас есть оранжевый флуоресцентный белок в качестве акцептора, мы переходим теперь
  00: 11: 47.25 к почти 5,5 нм. Если мы используем цитрин с красным флуоресцентным белком
  00:11:51.26 в качестве акцептора, мы можем приблизиться к 6 нм. Обычно это пары
  00: 11: 58.23, которые мы используем в настоящий момент для обнаружения FRET, особенно
  00: 12: 01.05 вот здесь, цитрин и вишня. У них очень хорошие свойства сворачивания
  00: 12: 05.14, и поэтому очень хорошо измерять взаимодействия
  00: 12: 08.11 в клетках с R0, близким к 6 нм.
  00: 12: 12.09 Итак, вернемся к нашему обнаружению совпадений, если вы просто измеряете
  00: 12: 16.29 совпадений молекул путем совместной локализации с помощью микроскопа,
  00:12:20.16 наш обнаруживаемый элемент объема слишком велик по сравнению с
  00: 12: 24.12 с нашим обнаруживаемым объемом. Если вы теперь посмотрите на совпадение молекул
  00: 12: 29.18 с использованием FRET, мы перейдем к тому
  00: 12: 32.27, который находится в том же порядке, что и объем молекул, который
  00: 12: 36.21 мы хотим обнаружить. Итак, мы находимся в области субзептометра или шкалы субзептометра
  00: 12: 40.23 для R0, например, 4,6 нм.
  00: 12: 45.11 Здесь важно отметить, что FRET — это не метод
  00:12:49.16 для улучшения разрешения. Это не похоже на технику сверхвысокого разрешения.
  00: 12: 52.07 Он дает вам сигнал о том, сколько молекул в объемном элементе
  00: 12: 57.17 фактически взаимодействуют, пропорционально количеству взаимодействующих молекул
  00: 13: 00.08. Это важный момент. Так что нет
  00: 13: 03.06 увеличения разрешения. Итак, что мы на самом деле измеряем
  00: 13: 07.29 при количественной оценке FRET? Итак, подходы разные, но на самом деле
  00: 13: 12.11 мы измеряем кажущуюся эффективность.И эта измеренная эффективность,
  00: 13: 15.11, равна реальной эффективности передачи, как определено только
  00: 13: 19.26 для комплекса. Итак, у вас есть FRET.
  00: 13: 24.16 На самом деле это геометрический параметр, он дает
  00: 13: 28.00 информацию о расстояниях и углах. В некотором смысле это
  00: 13: 31.07 мера конформации молекулы. Кажущаяся эффективность
  00: 13: 38.03 также пропорциональна доле взаимодействующих молекул
  00:13:41.29 на каждый объемный элемент. И это действительно изображение, поэтому здесь
  00: 13: 45.23 мы можем посмотреть на развитие реакции. Итак, сколько молекул
  00: 13: 50.14 взаимодействуют в этом конкретном элементе объема, который у нас
  00: 13: 56.00 по сравнению с здесь? На самом деле это биологически значимый параметр
  00: 14: 01.00, который является локальным параметром, который дает нам реальную карту
  00: 14: 05.23. В то время как эффективность не является локальным параметром, это на самом деле
  00: 14: 13.09 глобальный параметр, который определяется только свойствами молекулы.
  00: 14: 16.24 Я вернусь в это владение. Итак, прежде чем я подробно остановлюсь на различных подходах
  00: 14: 25.06 к измерению FRET в микроскопе,
  00: 14: 27.15 следует рассмотреть один важный момент, а именно форму спектра
  00: 14: 32.04. Итак, когда вы смотрите на спектры поглощения,
  00: 14: 35.29 всегда есть хвост в синей части спектра,
  00: 14: 40.04 и крутые в красной части спектра. Это типично.
  00: 14: 45.04 Когда вы смотрите на спектр излучения, флуоресцентное излучение
  00:14:49.13 спектров, они делают с точностью до наоборот. Они очень крутые
  00: 14: 52.23 в синей части спектра, но тянутся к красной.
  00: 14: 58.03 И поэтому мы можем специально возбуждать акцептор, вы можете видеть
  00: 15: 08.18, когда мы возбуждаем акцептор, мы не возбуждаем донора, но
  00: 15: 11.12 мы не можем возбуждают донора, не возбуждая акцептора.
  00: 15: 15.13 Точно так же мы можем обнаружить донора, не обнаруживая
  00: 15: 21.18 акцептора, но не детектировать акцептор без
  00:15:27.23 обнаружение донора. Таким образом, эти два конкретных возбуждения акцептора
  00: 15: 34.16, конкретное обнаружение донора, имеют отношение к тому, что я собираюсь
  00: 15: 38.09 уточнить, когда мы говорим об измерениях, чтобы получить
  00:15 : 42.20 FRET — к измерению FRET под микроскопом.
  00: 15: 45.27 Итак, это наиболее прямой и простой подход
  00: 15: 50.14, который часто использовался в прошлом. Это чисто основано на факте
  00: 15: 56.11, что если у вас есть FRET, вы подавляете донора, но вы
  00:15:59.28 увеличивают интенсивность акцептора за счет сенсибилизированного излучения.
  00: 16: 03.00 Итак, вы возбуждаете акцептор этим процессом. Итак, что вы делаете:
  00: 16: 06.24 возбуждает донора и вы измеряете изображение донора, то есть изображение эмиссии донора
  00: 16: 14.09. И вы измеряете эмиссию акцептора
  00: 16: 19.12, возбуждая донора. И вы видите, что у вас есть два изображения,
  00: 16: 23.23, которые вы соотносите таким образом. Итак, возбуждение донора и испускание акцептора
  00: 16: 26.27, возбуждение донора и испускание донора.
  00: 16: 30.18 Теперь, поскольку у нас есть проблема в том, что у нас все еще есть
  00: 16: 34.09 красное возбуждение акцептора, и мы истекли через
  00: 16: 37.28 донора, это работает только тогда, когда донор и акцептор
  00: 16: 42.18 находятся в одной молекуле, то есть в одном полипептиде.
  00: 16: 46.28 Необходимо поддерживать стехиометрию донора и акцептора
  00: 16: 53.06 постоянной в каждом пикселе. Таким образом, это специально работает, например,
  00: 16: 57.25 для датчиков, таких как хамелеон, которые могут измерять изменение
  00:17:01.04 в физиологическом параметре, таком как кальций, но может также
  00: 17: 03.25 измерять фосфорилирование. И снова я приведу пример
  00: 17: 05.09. Итак, у нас есть конструкция, которую можно измерить
  00: 17: 11.16 ратиометрическим способом. Итак, это рецептор эпидермального фактора роста, его
  00: 17: 15.05, имя ErbB-1, где у нас теперь в одной цепи донор
  00: 17: 20.28 CFP, у нас есть домен PTB, специфически распознающий фосфотирозины,
  00: 17: 25.16, и у нас есть желтый флуоресцентный белок в качестве акцептора.
  00: 17: 28.24 Поймите, что в любой конформации, которая уже может иметь
  00: 17: 33.14 базальный FRET, вы видите только изменение конфигурации. Итак,
  00: 17: 37.26 изменилась эффективность FRET. Таким образом, это измерение дает вам в некотором роде
  00: 17: 41.18 относительную меру конформации молекулы.
  00: 17: 46.12 Это очень легко реализовать. Это можно сделать в самых разных типах настроек
  00: 17: 51.16, таких как конфокальные настройки или широкопольное отображение,
  00: 17: 54.08 с правильными наборами фильтров, это очень быстро, потому что вам просто нужно
  00:17: 56.26 получить два изображения. Это не количественно, вы можете измерить только
  00: 17: 59.29 различий в состояниях. И вам нужно сохранить стехиометрию донора
  00: 18: 04.05 и акцептора постоянной. По сути, это означает, что это должна быть одна и та же конструкция
  00: 18: 07.28. Вот пример того, как выглядит такой эксперимент
  00: 18: 13.13. Таким образом, мы выразили эту конструкцию в клетках Cos7
  00: 18: 16.18. Вы видите флуоресценцию YFP здесь, где вы видите добавление
  00:18:20.18 рецепторов на мембранах, а также на пузырьках внутри.
  00: 18: 23.17 И здесь мы измеряем, что происходит, когда вы добавляете EGF, вы на самом деле
  00: 18: 26.23 активируете рецептор. Синий представляет собой фосфорилированный рецептор
  00: 18: 29.22. Итак, вы видите, что внутри цитоплазмы
  00: 18: 31.29 есть область, которая показывает активный рецептор, но есть также область внутри цитоплазмы
  00: 18: 35.20, где находится неактивный рецептор, где он становится
  00: 18: 38.08 неактивный. Итак, здесь мы видим в конце последовательности
  00:18:42.14 мы можем фактически ингибировать активность киназы, и все это дает
  00: 18: 45.19 резервное копирование, потому что мы ингибируем активность киназы, которая не может затем
  00: 18: 49.24 самофосфорилироваться или аутофосфорилироваться. Итак, давайте переместим
  00: 18: 53.22 на один шаг дальше и попробуем использовать измерение, которое на
  00: 18: 59.03 немного более количественное, чем этот подход. Где мы действительно можем использовать донор
  00: 19: 02.09 и акцептор на отдельных белках. Итак, это подход
  00:19:06.26 сенсибилизированное излучение. В идеальной ситуации, если бы вы могли
  00: 19: 11.22 возбудить донора, не возбуждая акцептор,
  00: 19: 16.28, и мы бы отслеживали флуоресценцию акцептора, и мы получили бы только
  00: 19: 20.00. излучение акцептора при передаче энергии.
  00: 19: 23.25 Таким образом, мы бы в основном создавали изображение, на котором мы возбуждали донора
  00: 19: 27.19 и обнаруживали акцептор. Проблема, конечно же, в том, что
  00: 19: 33.00 мы напрямую возбуждаем акцептор, и мы стравливаем
  00:19:41.23 через донор в акцепторном канале. Итак, изображение
  00: 19: 48.01, где вы возбуждаете донора и смотрите на акцептор,
  00: 19: 52.04 не соответствует сенсибилизированному излучению. У нас есть загрязнение
  00: 19: 55.11 от прямого возбуждения и просачивание. А теперь, прежде чем я
  00: 20: 00.12 пойдите немного дальше, посмотрите на спектры. Мы не можем действительно смотреть
  00: 20: 06.15 в нашем примере, где у нас есть донор и акцептор.
  00: 20: 09.27 мы не можем точно определить, сколько акцептора прошло.
  00: 20: 12.28 Однако мы можем измерить количество
  00: 20: 16.20, принимаемое при возбуждении непосредственно на его пике. Потому что там мы не возбуждаем
  00: 20: 19.09 донора, так что это очень специфично. Итак, если мы каким-то образом знаем
  00: 20: 22.27, скажем, соотношение между этими двумя, которое составляет фиксированное число
  00: 20: 26.23. Тогда мы могли бы определить, измерив здесь
  00: 20: 30.21, сколько там. Точно такая же ситуация с донором
  00: 20: 34.23.Мы не можем проводить измерения в образце, где есть донор и акцептор
  00: 20: 39.00, потому что у нас есть излучение акцептора.
  00: 20: 44.00 Но мы можем конкретно измерить донора, поэтому мы снова знаем, что отношение
  00: 20: 49.13 — это соотношение, которое измеряя здесь, мы можем определить
  00: 20: 53.09, сколько там. Пока спектр, форма неизменна.
  00: 20: 57.01 Итак, как нам сделать это исправление? Как мы определяем
  00: 21: 02.22 эти поправочные коэффициенты? Забираем пробу только с донором
  00:21:07.25 и определим, в основном, соотношение между этим и этим, и мы возьмем образец
  00: 21: 14.16 только с акцептором, и мы возьмем соотношение между этим
  00: 21: 16,27 и этим. Таким образом, измеряя образец, в котором есть донор
  00: 21: 22.06 и акцептор, возбуждая акцептор, мы можем определить, насколько сильно мы
  00: 21: 26.01 непосредственно возбуждаем акцептор. Вот как проходит эксперимент.
  00: 21: 32.23 Мы выражаем донора, в данном случае мы собираемся исправить кровотечение.
  00: 21: 37.07 Мы возбуждаем донора, у нас только что есть спектр донора,
  00: 21: 41.16, потому что нет акцептора, и измеряем при испускании
  00: 21: 46.07 акцептора. Другими словами, чтобы исправить в образце, где есть донор
  00: 21: 53.15 и акцептор, нам нужно знать, как это соотносится с интенсивностью
  00: 21: 58.15. Итак, мы измеряем на пике донора
  00: 22: 03.23, и теперь, используя это соотношение, мы должны масштабировать наш поправочный коэффициент
  00: 22: 09.06, с помощью которого нам нужно скорректировать изображение, на котором мы возбуждаем донора
  . 00:22:14.06 и измерьте донор, чтобы вычесть его из сенсибилизированного излучения
  00: 22: 18.28 или канала FRET. Очень похож на
  00: 22: 25.18 принцип коррекции прямого возбуждения.
  00: 22: 28.01 Теперь возьмем образец, который теперь содержит только акцептор
  00: 22: 31.16. В образце, где у нас есть донор и акцептор,
  00: 22: 37.17, мы не можем определить их количество, потому что это также донор.
  00: 22: 41.04 Итак, мы проводим измерения в образце, в котором есть донор и
  00:22:48.02 acceptor, эта часть, чтобы мы знали, сколько там. Итак, нам нужно
  00: 22: 52,08 получить соотношение, и это точно такая же ситуация. Таким образом,
  00: 22: 55.18 в основном получает поправочный коэффициент увеличения масштаба, где мы берем изображение
  00: 22: 59.20 только с акцептором и возбуждаем донора,
  00: 23: 02.17 вот где у нас есть прямое возбуждение, измерьте акцептор,
  00: 23: 08.00, разделенный на изображение прямого возбуждения акцептора
  00: 23: 11.05 и измерение акцептора.Итак, сенсибилизированная эмиссия
  00: 23: 15.16 строится следующим образом. У нас есть донорное возбуждение и излучение акцептора
  00: 23: 22.06, в идеальном мире это было бы сенсибилизированное излучение
  00: 23: 26.20, однако у нас есть вклады
  00: 23: 29.00 от донора, просачивающегося насквозь и акцептор прямого возбуждения.
  00: 23: 35.04 Потому что вы можете измерить донора в образце, который содержит как донор, так и акцептор
  00: 23: 40.14, особенно на длине волны донора
  00:23:42.19 вы получаете меру этого выпуска за обрез, через которую вам нужно скорректировать
  00: 23: 46.28 с помощью этого скалярного множителя. Точно такая же ситуация для прямого возбуждения
  00: 23: 51.03 акцептора. Итак, у нас в основном три изображения:
  00: 23: 56.07 мы берем донорное возбуждение / акцепторное излучение, донор
  00: 24: 00.23 возбуждение / донорское излучение, акцепторное возбуждение / акцепторное излучение.
  00: 24: 04.26 А затем в отдельном эксперименте мы определяем эти два скалярных фактора
  00: 24: 07.28. И мы делим это на интенсивность акцептора,
  00:24:14.27, таким образом возбуждая излучение акцептора и акцептора, и мы получаем меру
  00: 24: 18.27 кажущейся эффективности, которая пропорциональна реальной эффективности
  00: 24: 22.26 и доле взаимодействующих молекул. Так что это очень легко реализовать на стандартных микроскопах
  00: 24: 29.03, вы можете сделать это в конфокальном микроскопе
  00: 24: 31.09, вы можете сделать это в широкопольном микроскопе с подходящим
  00: 24: 34.22 наборы фильтров. Это довольно быстро, потому что можно переключить
  00:24:39.19 ваши фильтры очень быстро на колесе фильтров или на конфокальном микроскопе
  00: 24: 43.15 вы можете сделать это почти одновременно. Или вы можете сделать это одновременно
  00: 24: 45.24. Он полуколичественный, потому что вы получаете нечто пропорциональное
  00: 24: 50.07 относительной концентрации взаимодействующих молекул.
  00: 24: 53.12 Проблема здесь, конечно, зависит от этой внешней калибровки,
  00: 24: 57.05, поэтому получите скалярные коэффициенты, где вам нужен образец с донором
  00:25:00.11 и только акцептор, что также делает его очень чувствительным к шуму.
  00: 25: 04.27 И еще одно важное свойство, которое вам необходимо иметь
  00: 25: 07.08, это спектры, в основном инвариантные к окружающей среде,
  00: 25: 11.27, поэтому они не меняют свою форму в зависимости от окружающей среды. .
  00: 25: 15.01 Как, например, если это липидная среда или цитоплазматическая среда
  00: 25: 18.01. К счастью, это относится к флуоресцентным белкам
  00: 25: 21.11, потому что хромофор заключен в
  00:25:23.29 стволов. Окружающая среда определяется бочками.
  00: 25: 26.04 Итак, пример здесь, мы снова используем ту же систему,
  00: 25: 31.14, у нас есть рецептор эпидермального фактора роста, теперь присоединенный к донору
  00: 25: 35.12. Теперь у нас есть отдельная экспрессия этого домена PTB
  00: 25: 39.21, который распознает фосфотирозин, помеченный акцептором.
  00: 25: 42.24 Поскольку мы вносим исправления, мы можем поместить их в отдельные конструкции
  00: 25: 46.13. Нам не нужно их прикреплять. Итак, вот в основном
  00:25:50.00 — роль, которая представляет распределение в пространстве рецептора
  00: 25: 54.15, у вас есть домен PTB, и здесь мы имеем
  00: 25: 57.18 кажущуюся эффективность. Теперь это очень простой эксперимент,
  00: 26: 00.25 в основном без стимуляции, вы можете видеть, что это уже активный рецептор
  00: 26: 03.18. Здесь уже есть взаимодействие. Когда мы добавляем
  00: 26: 06.16 EGF, вы получаете увеличение взаимодействия, которое активировало больше рецепторов
  00: 26: 09.25. Когда мы добавляем ингибитор киназы, короткий
  00:26:15.29 раз он все еще остается, потому что фосфатазе требуется некоторое время, чтобы
  00: 26: 19.04 фактически фосфорилировали рецептор, но при более длительном периоде
  00: 26: 21.13 это взаимодействие снова теряется. Итак, это третий подход, основанный на интенсивности
  00: 26: 29.15, который я опишу. Из подходов, основанных на интенсивности,
  00: 26: 32.28 это самый количественный показатель. Но у него есть большой недостаток
  00: 26: 36.04 по сравнению с предыдущими методами, которые я описывал.
  00: 26: 38.20 Вы можете использовать его только в фиксированных ячейках, что очень сложно сделать в
  00:26:42.10 живых систем. Преимущество этого подхода в том, что он
  00: 26: 46.13 очень надежен и является достаточно количественным. Так как это работает?
  00: 26: 51.26 Это так. Мы возбуждаем донора, а затем смотрим на эмиссию донора
  00: 26: 58.12. Если FRET продолжается, донор должен быть погашен
  00: 27: 03.02. И поэтому от него меньше излучения, потому что это настоящий канал безызлучательного распада
  00: 27: 06.02. Что мы хотели бы знать
  00: 27: 13.16, какова интенсивность донора в отсутствие акцептора?
  00:27:17.07 Используя это, очень легко рассчитать КПД.
  00: 27: 22.17 Теперь мы не можем провести отдельный эксперимент, в котором мы измеряем только донор
  00: 27: 27.07, потому что это будет совершенно другая конфигурация,
  00: 27: 28.28 и другая концентрация молекул и так далее.
  00: 27: 30.28 Итак, мы делаем следующее. Мы возбуждаем акцептор
  00: 27: 34.19, и вы можете делать очень специфические, и в основном возбуждать до тех пор, пока его
  00: 27: 37.25 не выцветет полностью. Итак, мы разрушили приемные антенны.
  00: 27: 41.20 После этого мы повторно измеряем донора. И тогда
  00: 27: 45.23 донор разомкнется и интенсивность возрастет,
  00: 27: 49.01 и у вас будет ситуация с отсутствием акцептора.
  00: 27: 55.00 Конечно, в живой камере, где все движется очень быстро, это невозможно. Вы измените взаимодействия, вы измените
  00: 28: 02.01, где находятся молекулы, и это больше не будет хорошей мерой.
  00: 28: 05.03 Вот почему вы хотите делать это в фиксированных ячейках.Теперь очевидная эффективность
  00: 28: 09.09 в основном равна 1 минус донор в ситуации, когда у вас есть подавленный акцептор
  00: 28: 14.10, а затем донор в ситуации
  00: 28: 20.07, где у вас есть фотообесцвечивает акцептор. Так выглядит
  00: 28: 25.01 в реальном эксперименте. Здесь мы снова имеем ту же систему
  00: 28: 30.06, чтобы провести это сравнение. Итак, снова у нас есть эпидермальный рецептор фактора роста
  00: 28: 32.25, и в этом случае мы фактически смотрим на
  00:28:35.20 фосфорилирование тирозинов с помощью антитела
  00: 28: 38.24, которое имеет химический акцептор, небольшую метку в качестве акцептора.
  00: 28: 45.11 Это в фиксированных ячейках, до фотообесцвечивания или акцептора.
  00: 28: 48.15 Фотообесцвечивание. Лучше всего это делать в фиксированных ячейках, сложно в живых ячейках
  00: 28: 51.12. И мы в основном инкубировали с этим антителом.
  00: 28: 55.00 Дело в том, что это антитело не специфично
  00: 28: 57.14 для фосфотирозинов EGFR, оно также распознает любые
  00:29:01.09 фосфотирозин. Однако, поскольку мы измерили
  00: 29: 04.12 близость этого антитела к этой молекуле с помощью FRET,
  00: 29: 07.01 вы получили высокоспецифичный сигнал фосфорилирования
  00: 29: 10.21 рецептора. Специально для этого рецептора. Итак, здесь у вас есть
  00: 29: 15.10 в основном только донор, это распределение рецепторов,
  00: 29: 18.03 здесь ниже распределение акцепторов, это антитела.
  00: 29: 21.21 Именно там происходит фосфорилирование.А затем
  00: 29: 24.15 вы фотообесцвечиваете в этом прямоугольнике акцептор, вы можете видеть, что
  00: 29: 30.12 исчез. Мы сделали это в конфокальном микроскопе
  00: 29: 32.25, поэтому мы просто взяли область, представляющую интерес, и фотообесцвечивали ее там
  00: 29: 35.21. Это делается в эталонной версии.
  00: 29: 39.00 И то, что вы видите в доноре, вы на самом деле видите, как оно увеличивается
  00: 29: 40.28 в интенсивности там, где у вас был FRET, с чем вы сравниваете это
  00:29:44.14 здесь, например, здесь.
  00: 29: 47.08 Это также очень хорошо видно на этом изображении, где у вас есть
  00: 29: 51.01 разница между этими двумя, и поэтому вы видите в основном
  00: 29: 54.25 разжимаемости по сравнению с эталонной версией, где почти нет
  00: 29: 56.29 что-нибудь происходит. Теперь, если вы возьмете 1 минус это изображение
  00: 30: 01.20, разделенное на это изображение, вы получите очевидную эффективность FRET,
  00: 30: 05.03, которая показывает, что у вас активный рецептор в основном
  00:30:08.03 на плазматической мембране и очень мало активного рецептора
  00: 30: 12.03 на этом внутреннем пузырьке. Так что в основном это дефосфорилированное
  00: 30: 17.00 в этом отсеке. Так что этот подход очень легко реализовать,
  00: 30: 21.24 он очень надежен. Фактически он используется в качестве стандарта, чтобы доказать
  00: 30: 26.14, что FRET работает. Это очень медленно, и это самый большой недостаток.
  00: 30: 32.05 Не подходит для визуализации живых клеток. Возможно, здесь есть решение
  00: 30: 35.21, используя фотохромные красители или переключаемые красители, которые вы можете
  00:30:39.12 переключаться вперед и назад, включать и выключать, чтобы делать это в живых клетках.
  00: 30: 42.02 Я не собираюсь это обсуждать. Он полуколичественный, но вы получаете
  00: 30: 46.26 что-то, что пропорционально доле действительной эффективности комплекса
  00: 30: 49.06. В этом смысле это самый количественный
  00: 30: 53.06 с точки зрения методов, основанных на интенсивности. И вам не нужна внешняя калибровка
  00: 30: 56.10, как это было в случае измерений сенсибилизированного излучения
  00: 30: 59.09. Благодаря этому отбеливанию у вас есть внутренний контроль.
  00: 31: 02.19 Еще один пример, который я покажу здесь, просто чтобы показать вам
  00: 31: 08.13, что вы можете использовать этот подход, например, для создания трехмерной карты
  00: 31: 11.28 взаимодействие. В этом случае мы рассмотрели
  00: 31: 14.24 взаимодействия между эпидермальным фактором роста и фосфатазой
  00: 31: 18.24, называемой PTP1B, которая находится на поверхности ER.
  00: 31: 22.07 И мы использовали специфический отслеживающий мутант, который имеет стабильное взаимодействие
  00: 31: 25.25 со своим субстратом.Итак, мы хотели знать, где
  00: 31: 27.29 фактически действует фосфатаза на фактор роста эпидермиса.
  00: 31: 31.08 Итак, вы берете стопки доноров, так что вы берете полную стопку
  00: 31: 36.10, чтобы получить трехмерное распределение
  00: 31: 38.28 вашего донора. Затем вы фотообесцвечиваете акцептор всего лишь путем сканирования
  00: 31: 42.23 по одной плоскости, потому что дозовый эффект фотообесцвечивания
  00: 31: 45.20 просто остается в одном месте, по крайней мере, при приближении одного фотона.
  00:31:49.01 Вы полностью обесцвечиваете акцептор, затем повторно снимаете
  00: 31: 52.15 трехмерной стопки, и вы просто берете 1 минус соотношение
  00: 31: 55,07 этих двух изображений, и вы получаете очевидную эффективность
  00: 31: 59.01. . И теперь вы можете видеть в этой зеленой зоне, где в основном происходит это взаимодействие
  00: 32: 02.23. Вы можете ясно видеть, что именно здесь рецептор
  00: 32: 05.13 дефосфорилируется, в основном внутри клетки.
  00: 32: 10.15 Итак, это последний подход, который я собираюсь описать.И я,
  00: 32: 16.23, собираюсь более подробно остановиться на втором семинаре, который конкретно касается
  00: 32: 19.27, потому что это наиболее количественный подход
  00: 32: 21.24, но он также включает в себя немного больше, я бы сказал, техническое
  00: 32: 25.20 оборудование. Более сложное оборудование, но также и более сложные методы анализа. И об этом стоит поговорить отдельно.
  00: 32: 35.11 На самом деле главным преимуществом является количественная оценка. Итак, измеряя
  00: 32: 41.00 FRET с помощью микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции, что мы делаем здесь
  00:32:44.01 — это время жизни донора в возбужденном состоянии.
  00: 32: 46.17 Итак, вы возбуждаете донора и измеряете донора, что вы можете сделать, в частности,
  00: 32: 52.04, не видя акцептора. И вместо измерения интенсивности
  00: 32: 55.28 мы измеряем распад возбужденного состояния
  00: 32: 59.14 как функцию времени.
  00: 33: 04.14 А если у вас есть FRET, то у вас есть дополнительный канал
  00: 33: 07.10 неизлученного распада. Итак, вы депопулируете возбужденное состояние
  00:33:09.27 быстрее, а это означает, что вы всегда получите более короткий
  00: 33: 12.26 или более быстрое распадание, что означает более короткое время жизни.
  00: 33: 17.27 Теперь, чтобы дать вам представление о том, как это выглядит, у меня есть пример
  00: 33: 22.13, к которому я вернусь на своем втором семинаре.
  00: 33: 24.18 Где мы рассмотрели взаимодействие между Ras, который является
  00: 33: 28.24 центральным в передаче сигнала, к которому присоединена донорная молекула
  00: 33: 32.17 Цитрин. И эта молекула называется PDEd, то есть
  00:33:36.20 GDI-подобный солюбилизирующий фактор с прикрепленной к нему вишней.
  00: 33: 41.04 Мы заинтересованы в этом взаимодействии, потому что оно имело
  00: 33: 44.12 важность для пространственной организации Ras, и нам нужно знать, где это взаимодействие
  00: 33: 47.23 происходит внутри клеток. Таким образом, мы в основном измерили
  00: 33: 51.09 FRET, и мы делаем это специально, измеряя свойства возбужденного состояния
  00: 33: 53.27 донора. Теперь, что мы получаем с FLIM
  00: 33: 59.10 в одном эксперименте, это истинная эффективность в комплексе
  00:34:05.21, который является геометрическим параметром, с космическим вариантом.
  00: 34: 10.00 Это единственное свойство комплекса, которое позволяет что-то сказать о
  00: 34: 14.21 экстерьере. Если вы возьмете каппа в квадрате, игнорируя каппа в квадрате,
  00: 34: 17.21, мы фактически можем сказать, что имеется 50% -ный коэффициент передачи энергии
  00: 34: 20.17 и расстояние передачи примерно 6 нм.
  00: 34: 23.16 Но это очень опасно. Более важным и действительно актуальным для биологов
  00: 34: 28.11, на мой взгляд, является этот параметр альфа, который равен
  00:34:33.21 доля взаимодействующих молекул в каждом пикселе или пространственном
  00: 34: 39.05 разрешаемом элементе. Это представляет прогрессию реакции
  00: 34: 42.16, где происходят взаимодействия, и это действительно карта
  00: 34: 45.07 в отличие от E, которая не является картой, это просто скаляр.
  00: 34: 49.14 Это свойство комплекса, это свойство, которое изменяется как функция
  00: 34: 53.29 пространства. Итак, здесь мы получаем фракцию в нашей таблице условных цветов
  00: 34: 59.26 — долю взаимодействующих молекул.В данном случае Ras
  00: 35: 04.09 взаимодействует с PDEdelta, и вы можете видеть прямо здесь, что с плазматической мембраной
  00: 35: 07.18 мы не обнаруживаем взаимодействия. А в гольджи мы не находим взаимодействия
  00: 35: 10.12. Тогда как здесь вы видите взаимодействие в цитоплазме
  00: 35: 12.29. И это очень важно, чтобы связать, скажем, состояние
  00: 35: 16.27 Ras с его взаимодействием с PDEdelta.
  00: 35: 25.06 Итак, в следующий раз я собираюсь более подробно остановиться на этой флуоресценции
  00:35:29.00: 00: 35: 36.05 представьте себе микроскопию, потому что она заслуживает отдельного обсуждения
  00: 35: 31.25, потому что это наиболее количественный подход
  00: 35: 36.05, который позволяет количественно оценить биологию и лучше понять
  00: 35: 40.08, как молекулярные реакции, для Например, важны для пространственной организации.

  Какое давление в резине лада гранта. Как измерить давление в шинах лада гранта

  Для безопасного и комфортного вождения следует периодически проверять давление в шинах.Для каждой марки и размера шин завод рекомендует определенное рекомендуемое значение давления воздуха. Поскольку на глаз невозможно определить, что давление соответствует рекомендуемому значению, для его измерения используются специализированные приборы — манометры. Используйте только продукцию высокого качества с меньшей заявленной погрешностью.

  Для измерения давления в шинах Lada Granta открутите защитный колпачок от ниппеля (клапана):

  Теперь проверьте давление манометром. Также в насос можно встроить манометр.Убедитесь, что давление находится в пределах рекомендуемого давления. В случае отклонения от нормы доведите давление до рекомендуемого значения. br />
  

  Если давление в шине слишком высокое, выпустите воздух до рекомендованного значения, нажав на металлический стержень в центре клапана шины.

  Не забудьте надеть защитные колпачки на клапаны после окончания работ.

  Зачем следить за давлением?

  Шины с высоким или низким давлением изнашиваются неравномерно. В результате может заметно ухудшиться управляемость автомобиля или может произойти внезапный разрыв.Это может привести к аварийной ситуации на высокой скорости.

  НАШИ ПАРТНЕРЫ:

  Сайт о немецких автомобилях

  Любой современный легковой или грузовой автомобиль можно обслужить и отремонтировать самостоятельно, в обычном гараже. Все, что для этого потребуется, — это набор инструментов и заводская инструкция по ремонту с подробным (пошаговым) описанием операций. В таких инструкциях должны быть указаны типы применяемых рабочих жидкостей, масел и смазок, а главное — моменты затяжки всех резьбовых соединений деталей узлов и агрегатов автомобиля.Итальянские автомобили — Fiat (Fiat) Alfa Romeo (Альфа Ромео) Lancia (Lancia) Ferrari (Феррари) Mazerati (Мазерати) имеют свои конструктивные особенности. Также в специальной группе можно выделить все французские автомобили — Peugout (Пежо), Renault (Renault) и Citroen (Ситроен). Немецкие машины сложны. Особенно это касается Mercedes Benz (Mercedes Benz), BMW (BMW), Audi (Audi) и Porsche (Porsche), чуть меньше — Volkswagen и Opel (Opel). Следующая большая группа, выделенная по конструктивным особенностям, — это американские производители Chrysler, Jeep, Plymouth, Dodge, Eagle, Chevrolet, GMC, Cadillac, Pontiac, Oldsmobile, Ford, Mercury, Lincoln… Из корейских фирм следует отметить Hyundai / Kia, GM — DAT (Daewoo), SsangYong.

  Еще недавно японские автомобили отличались относительно невысокой начальной стоимостью и доступными ценами на запчасти, но в последнее время по этим показателям они догнали престижные европейские бренды. Причем практически в одинаковой степени это касается всех марок автомобилей из страны восходящего солнца — Toyota (Toyota), Mitsubishi (Mitsubishi), Subaru (Subaru), Isuzu (Isuzu), Honda (Honda), Mazda (Mazda). или, как говорили ранее, Мацуда), Сузуки (Сузуки), Дайхатсу (Дайхатсу), Ниссан (Ниссан).Ну и автомобили, выпускаемые под японско-американскими брендами Lexus (Лексус), Scion (Scion), Infinity (Инфинити),

  Среди автомобилистов ведутся споры о том, какое давление должно быть на автомобиль «Лада Калина», «Гранта» или любую другую модель этого российского производителя. Одни смотрят в паспорте и накачивают шины в соответствии с нормативными значениями, другие пробуют несколько вариантов давления в колесах.

  Однозначно можно сказать, что давление в шинах «Гранта», «Калина» или «Приора» влияет на ходовую часть, влияет на расход топлива, а также способствует или предотвращает быстрый износ шин.

  
  Нормативные значения давления в колесах

  В «Жигули» есть 3 варианта состояния давления в колесах:

  • занижены. Наблюдается увеличение контакта поверхности колеса «Гранта», «Приора» или «Калина» с дорожным покрытием, что ускоряет износ изделия. Топливо расходуется быстрее, а тормозной путь длиннее;
  • завышена. Колеса автомобиля меньше соприкасаются с дорожным покрытием, что увеличивает вероятность досрочного ремонта ходовой части.Увеличивается также скорость износа колес. При этом ухудшается управляемость автомобиля на высокой скорости или крутых поворотах. Пассажиры и водитель чувствуют, что поездка на автомобиле становится менее комфортной — машина подпрыгивает даже на небольших неровностях;
  • нормальный. Под таким давлением подразумевается показатель, находящийся в пределах 5-15% от того, что указано на автомобиле или в паспорте. В этом случае шины изнашиваются равномерно. Находиться в машине при движении по неровному дорожному покрытию или бездорожью комфортно.

  Особенности накачки колес

  Для комфортного и безопасного вождения «Калины» зимой и летом необходимо измерять степень накачивания колес механическим или электронным манометром.

  
  Допустимое давление воздуха в шинах автомобилей Лада Приора

  Оптимальный уровень накачки вы также увидите в таблице, представленной каждым производителем шин. Значения в нем корректируются в зависимости от:

  • количество пассажиров, багажа;
  • моделей автомобилей (показатели «Гранты», «Приоры» и других моделей Lada различаются в зависимости от их веса).

  Не забывайте поддерживать одинаковое давление зимой и летом.

  
  Рекомендуемое давление в шинах автомобилей Lada Granta

  Однако есть нюанс: если «Лада Калина» длительное время стояла в теплом гараже или на СТО, приготовьтесь к небольшому снижению прокачки колес после выхода на холод.

  Таким образом, вам придется чаще накачивать шины своего автомобиля в холодное время года.

  Нормативное значение указателя давления в передних и задних колесах для «Лада Калина» должно быть следующим:

  • для модели ВАЗ-1117 — 1.9 атм на передние и задние колеса при частичной нагрузке, а также 1,9 / 2,1 на передние и задние колеса при полной нагрузке;
  • для модели ВАЗ-1118 — 1,9 или 2 атм при частичной нагрузке, а также от 1,9 до 2,2 атм при полной нагрузке на передние и задние колеса соответственно;
  • для модели ВАЗ-1119 — 2 атм при частичной и 2 / 2,2 атм при полной нагрузке на передние и задние колеса соответственно.
  
  Допустимое давление воздуха в шинах Лада-Калина

  Наличие до 3 человек в салоне автомобиля специалисты называют частичной загрузкой Приоры, Гранты или другой модели Лады, при условии, что багажник не загружен.Полная загрузка — максимально возможное количество пассажиров в машине и груза в багажнике (массой менее 50 кг).

  Если вы хотите узнать уровень накачивания колес, подождите, пока они остынут (после долгой поездки или пребывания на солнце). Это сделает показания манометра более точными.

  
  Размеры шин Лада-Калина

  Производители резины колес

  Для «Приоры», «Гранты» (лифтбэк) или другой модели Lada на рынке можно найти следующие типы резины:

  • Matador 175/70 R13 Nordicca MP 52 82T.Используется для езды в холодное время года. Продукт хорошо показал себя на сухих и влажных поверхностях, на льду и снегу. Если вы будете использовать продукцию для «Гранты» (седан или лифтбэк), накачайте колеса до 2 атм согласно инструкции производителя;
  • Bridgestone 175/70 R13 Blizzak Revo GZ 82s. Это группа нешипованных зимних колес с мягким составом протектора. Оборудован большим количеством ламелей. Для «Приоры» подходит значение давления от 2 до 2,5 атм, что позволяет характеристики продукции данной компании;
  
  Зимняя резина bridgestone Blizzak
  • Kleber 175/70 R13 Viaxer 82T.Улучшенная резиновая смесь предназначена для путешествий в теплое время года. Обладает точностью настройки, снабжен дренажными каналами. Оптимальная величина прокачки для таких продуктов — 2,2 атм;
  • Nokian 175/70 R13 Hakkapeliitta R2 82R. Он оформлен в елочку и оснащен ламелями. Он отличается мягкой резиной в протекторе и не накапливает снег в пятне контакта с дорожным покрытием. Надут от 2-х банкоматов, что подходит для Гранты;
  
  Зимняя резина Nokian Hakkapeliitta
  • Fulda 175/70 R13 Ecocontrol 82T.Предназначен для летнего использования, производство Польша. Производитель допускает накачку шин до 2,5 атм;
  • Barum 175/70 R13 Brillantis 2 82T. Рекомендован к использованию на «Гранте», «Приоре» и других типах Жигулей по соотношению цены и качества.

  Правильное давление в шинах — очень важный аспект безопасного вождения. Хотя этот показатель можно назвать относительным, поскольку он показывает соотношение доли воздуха к объему, а не просто измеряет его количество в шине. Но такие замеры нужно проводить постоянно, ведь систематический контроль обеспечит безопасность при вождении и долговечность компонентов автомобиля.Измерения проводятся с помощью специального прибора, называемого манометром. Они бывают разных типов и разных классов точности. Поэтому для постоянного использования стоит выбирать качественный прибор с высоким классом точности.

  Автомобили отечественного производителя Lada Granta популярны и по сей день. Это потому, что цена на них невысокая, и позволить себе такую ​​машину может даже среднестатистическая семья со средним достатком. Соотношение цены и качества примерно такое же, хотя некоторые модели Lada по-прежнему получают много негативных отзывов на форумах.Владельцы таких автомобилей часто не задумываются, какие нормы давления следует соблюдать. Они даже не знают, где указаны такие параметры. Аналогичную информацию можно найти в эксплуатационной книжке. Там производитель описывает, какие показатели подходят для какой модификации. Также указана информация о размерах шин, подходящих для таких автомобилей и количестве атмосфер для каждого из вариантов.

  Манометр в шинах

  Для 13-дюймовых шин допустимый предел при частичной нагрузке равен 1.9 атмосфер. А при полной загрузке они увеличиваются до 2,1 бар на задних шинах. Но уже колеса размером 14 дюймов нужно накачать до 2,0 бар. При максимальной загрузке автомобиля показатели должны составлять 2,2 бара на шинах заднего моста … Общая грузоподъемность автомобиля — 475 килограмм.

  На заметку.

  После того, как в шиномонтаже накачаны шины автомобиля, рекомендуется по приезду домой проверить уровень атмосферы собственным манометром.

  Очень часто сотрудники таких организаций не заморачиваются и прокачивают все шины до 2,0 бар. Причем для конкретной марки автомобиля такие показатели могут быть завышены или занижены. Поэтому прокачку нужно контролировать самостоятельно. Неправильное давление может вызвать множество проблем. Например, недостаточно накачанные шины могут привести к:

  • быстрое стирание боковых протекторов на резине;
  • перегрев шин и их преждевременный износ;
  • нарушение управляемости автомобиля, особенно на поворотах;
  • перерасход топлива.

  Недокачанные шины обладают и преимуществами:

  • мягкий ход автомобиля;
  • отсутствие шума и дребезжания внутри авто.

  Но недостатки явно перевешивают все достоинства. Чтобы не тратить деньги на новые шины, лучше придерживаться допустимых норм.

  Накачанные колеса также не очень хорошо влияют на состояние узлов и деталей автомобиля:

  • подвеска быстро изнашивается;
  • средний протектор на резине стерся;
  • машина едет тяжело;
  • в салоне можно услышать дребезжание и ощутить все неровности и ухабы на дороге.

  Плюс только в экономии топлива, но не стоит этому радоваться. Недостатки здесь явно перевешивают все достоинства.

  Замеры давления необходимо проводить только после трехчасового простоя автомобиля после поездки, на холодных шинах.

  
  Таблица давления в шинах «Лада»

  Давление в колесах Лады зимой

  В зимнее и летнее время давление внутри шины меняется из-за перепадов температуры окружающей среды.Например, летом, когда очень жарко, воздух внутри шины нагревается, и ее объем увеличивается. Поэтому колёса нельзя качать немного, порядка 0,3 атмосферы. А зимой происходит с точностью до наоборот. Из-за низкой температуры объем воздуха в шинах уменьшается, и поэтому их следует прокачивать еще и на 0,3 атмосферы.

  Очень важно, где находится автомобиль. Если он стоит в теплом помещении, то при измерении давления манометр покажет оптимальные значения.Но если выйти на улицу в морозную погоду, то показатели в шине упадут примерно на 0,4 бара. А машина уже будет ездить на недокачанных шинах, а это небезопасно. Поэтому колеса следует накачивать даже в гараже и показатели следует немного завышать, так как на морозе они падают.

  На заметку.

  Еще один фактор — загруженность автомобилей. Если колеса уже накачаны до требуемых параметров, учитываемых на морозе, а автомобиль загружен по максимуму, в этом случае также необходимо учитывать рекомендации производителя относительно показателей при повышенной нагрузке.В итоге получается, что прокачивать нужно с учетом снижения давления на морозе и при максимальной нагрузке.

  Поклонники универсала «Лада Калина» часто не задумываются об изменении давления в шинах в разное время года. Для таких автомобилей оптимальная производительность — 2,2 атмосферы на колесах передней оси и 2,3 — на задней. Большинство водителей согласны с этими рекомендациями производителя и не ощущают сильного дискомфорта во время вождения. Но зимой многие отклоняются от этих стандартов.В холодную погоду передние шины накачиваются до 2,0 бар, а задние — до 2,2 бар. Это с учетом того, что шины на машине заводские. Если машину поменять на широкопрофильные шины, то показатели давления увеличиваются. Должно быть 2,4 стержня спереди и 2,5 стержня сзади. Низкопрофильные и узкие шины требуют 1,9–2,0 АТМ на передней оси и 2,0–2,2 на задней.

  
  Калина

  Седан «Лада» Веста имеет большую максимальную грузоподъемность, чем предыдущая модель.Индекс грузоподъемности до 615 килограмм. В инструкции указаны параметры давления равные 2,1 атмосферы, как для передних колес, так и для задних. При увеличении нагрузки задние колеса нагнетаются до 2,2 бар. Такие показатели характерны для шин R15 и R16. Но зимой лучше держать давление в пределах 2,2 бар. Производитель рекомендует измерять количество воздуха в шине не реже одного раза в неделю. А также такое мероприятие необходимо провести перед длительной поездкой.

  Давление в шинах «Лада Веста Кросс» имеет несколько другие параметры.Заводские колеса на машине — R17, поэтому передние колеса требуют накачки до 2,2 атмосфер, а задние — до 2,4. Но если устанавливаются шины другого размера, то нужно руководствоваться общей таблицей давления «Жигули».

  Поклонникам модели Largus стоит знать, что атмосферные показатели у этой машины выше, чем у предыдущих рассматриваемых моделей. Давление в колесах Ларгус для шин R14 и R15 составляет 2,4 бар на передней оси и 2,6 бар на задней. Но владельцы таких автомобилей отмечают, что при таких параметрах машина очень жестко едет, поэтому часто занижают рекомендуемые показания.При этом сильного износа резины нет. Но не стоит увлекаться недооценкой, так как это может привести к кучей проблем. Если водитель любит быструю езду, то снижение давления на 1,0 бар будет вполне оправданным. Резина нагревается с большой скоростью, и объем воздуха увеличивается, поэтому это уменьшение не повлияет на нее.

  
  «Лада Хэтчбек»

  Указатели давления в шинах для «Лада Лифтбек» ​​летом

  Намек производителя на оптимальное давление можно найти на средней стойке водительской двери.По ее словам, количество атмосфер в такой машине должно составлять 2,0 атмосферы на всех четырех колесах с минимальной нагрузкой. Максимальная нагрузка автомобиля предусматривает изменение показателей до 2,2 бар на задней оси и 2,0 бар на передней.

  Летом, если машина стоит в прохладном гараже, показатели будут такими же, а при выходе машины на жару количество воздуха в шине увеличится. Поэтому перед поездкой стоит снизить давление примерно на 0,3 бар. Так удастся добиться максимально правильных параметров, которые заявлены производителем.Самое главное в этом случае — следить за поведением машины. Если автомобиль заносит на повороте или был замечен чрезмерный расход топлива, то нужно сразу же проверить давление и довести его до оптимальной производительности. В противном случае придется покупать новые запчасти и шины.

  
  Правильно накачанные шины

  Водитель должен систематически проверять давление. Если постоянно забывать о такой мелочи, то это может повлечь за собой множество последствий. Двигаясь на машине по оживленной трассе с неправильным давлением, вы можете подвергнуть опасности не только себя, но и других водителей и пешеходов.

  Для безопасного вождения необходимы автомобильные шины, так как давление в шинах Lada Grant меняется. Их размер должен соответствовать рекомендуемому номинальному давлению. Поскольку проверка этого параметра является важным моментом, для этого нужен специальный прибор — манометр. Он служит для измерения уровня давления. В этом случае полученные результаты следует сравнить с рекомендованными значениями.

  Важно использовать только высокоточные манометры с наименьшей заявленной погрешностью. Если во время измерений будет обнаружено давление ниже рекомендуемого, то это может вызвать ускоренный износ шин, ухудшение управляемости и устойчивости автомобиля, так как углы установки колес также меняются.

  Давление в шинах, рекомендованное производителем, указано в таблицах. Он измеряется в кг / м² в передних и задних шинах при частичной и полной нагрузке. В таблицах указано давление в шинах автомобиля Лада Гранта седан и лифтбэк. Размер шин зависит от комплектации, которая делится на люкс, стандарт и стандарт.

  Следует учитывать, что давление воздуха в помещении, оборудование которого относится к категории стандарт, отличается от других аналогичных показателей версий стандарт или люкс.Разница выражается в сотых. Первая версия оснащена колесами меньшего размера.

  Идеальный вариант — поддерживать этот уровень данного показателя, который был установлен производителем. Частичная загрузка предполагает, что в машине находится не более 3 взрослых и что в ней нет багажа или груза. Если в багажнике находится груз весом 50 кг, а в машине находится 3 и более человек, то предполагается полная загрузка.

  Подобные столы производитель предоставляет в салонах автомобилей и лифтбэках.Расположение стола — средняя стойка со стороны водителя.

  При движении автомобиля показатель тоже увеличивается. Правильно проверить давление воздуха в шинах автомобиля Лада Гранта можно только с помощью манометра. Причем уровень их температуры и окружающего воздуха должны иметь одинаковое значение.

  Как правильно проверить давление в шинах?

  Внешний вид шин автомобиля Lada Granta может быть нормальным даже при пониженном уровне параметра.Судить об этом параметре по внешним признакам невозможно. Следует провести измерения, чтобы убедиться, что он соответствует рекомендуемым значениям.

  Давление в шинах любого автомобиля, в том числе Lada Granta, не может быть постоянным независимо от того, зимняя резина на колесах или летняя. В условиях повышенной температуры показатель увеличивается. Если его понизить, то давление в зимних шинах упадет.

  Давление в шинах должно быть постоянным независимо от погодных условий

  Если разница температур составляет от 10 ° C до 15 ° C, этот параметр следует проверить.его практически не видно, так как зимние шины не нагреваются из-за замерзания воздуха и низких температур дорожного покрытия.

  Летом шины плохо охлаждаются из-за тёплого воздушного потока и горячего дорожного покрытия. Эти факторы увеличивают показания на 0,2-0,3 бар. Чтобы его уменьшить, нужно подготовить компрессор или насос, а также манометр. Все действия должны иметь определенную последовательность.

  Безопасная езда на любом автомобиле напрямую зависит от состояния колес. Важно не допускать быстрого износа шин.

  Как правильно снять мерки, чтобы увеличить жизнь Лада Гранта?

  Определенная комплектация автомобилей Lada Granta имеет соответствующие стандарты, которые характеризуются собственным уровнем исследуемого параметра.

  Если давление в шинах во время движения автомобиля Lada Granta не соответствует рекомендованным производителем нормам, то колеса этой модели претерпят преждевременный износ.

  Если параметры шин значительно изменились, их следует проверить на утечки газа.

  При заметном падении показателя следует проверить шины на герметичность. Возможно, причина только в этом, тогда катушка подтягивается или просто заменяется на новую. Если будет установлено, что катушка исправна, а давление снизилось, то причина может заключаться в неисправности шины. Возможно, был разгерметизирован его специальный защитный слой, тогда его демонтаж производится специальным приспособлением.

  Если была проверена балансировка колес, которая осталась в норме, то демонтаж следует начинать с отметки на шине специального места, где находится клапан.После того, как все работы будут выполнены, шина должна быть смонтирована в соответствии с отметкой.

  Для более равномерного износа шин менять колеса нужно каждые 30 тысяч километров. Для этого проводят следующие действия:

  1. Осмотрите покрышки Лада Грант с дисками, чтобы убедиться в отсутствии порезов, отслоения резиновых покрышек.
  2. Проверить наличие стального корда на предмет коррозии из-за проникновения влаги.
  3. Колпачки на колесах необходимо открутить, чтобы проверить давление в шинах.
  4. Если обнаруживается, что показатель больше, чем требуется, то надавите на кончик катушки, чтобы из шины вышла определенная часть воздуха.
  5. Затем индикатор снова измеряется.
  6. При постоянном падении индикатора, с помощью колпачка и ключа катушка наматывается максимально плотно.
  7. Чтобы проверить золотник на герметичность, смочите отверстие клапана.
  8. Если появляются пузырьки воздуха, замените катушку на колесе.
  9. Измерение остаточной глубины протектора шины штангенциркулем, замените его, если глубина устройства равна 1.6 мм или меньше.

  При отсутствии суппорта глубину можно проверить визуально в соответствии с параметрами износа шины, которые могут проявляться в виде полос, расположенных поперек протектора. При необходимости колеса подтягивают.

  Готовя Lada Granta к работе зимой, обязательно замените летние шины на зимние. Зимние шины необходимо использовать в обязательном порядке, если не планируется консервация автомобиля на холодное время года.

  4 марта, 16:00 Обновление прогноза погоды

  Обратите внимание на впечатляющую теплоту на следующей неделе на Равнинах, которые будут продвигаться на восток!

  Похоже, параметры ПРЕДЕЛЬНОГО РИСКА От Айовы до Техаса с областью параметров НЕБОЛЬШОГО РИСКА Оклахома, восточный Канзас до Миссури и Арканзас Среда.

  Некоторые параметры ПРЕДЕЛЬНОГО РИСКА могут проникнуть сюда с ночи среды по четверг утром, учитывая ветер со скоростью 5000 футов в час (низкоуровневый реактивный самолет) в среду вечером, а также некоторые участки поверхности и повышенную плавучесть (CAPE), а также вращающуюся полосу верхней струи со скоростью около 100 миль в час. после полуночи в среду вечером по четверг утром.

  Самая теплая температура в четверг должна быть утром, после полудня и после полудня следует постепенное снижение температуры, а затем в четверг вечером она стабилизируется.

  Дождь, вероятно, в пятницу, но неясно, где именно находится штормовая система. Если он проследит дальше на север, мы увидим 70-70-е годы и серьезный погодный риск (параметры от МАРГИНАЛА до СЛАБОГО РИСКА). Если он проследует дальше на юг, то закончится холодным дождем с небольшими сильными штормами.

  В следующие выходные также возможны осадки и штормы.

  Точный трек шторма определит точную температуру и любые опасные погодные условия.

  В любом случае, со среды по воскресенье выпадет 1,50–3 дюйма.

  Мысли о дожде и шторме около 16-17 марта с потенциально серьезным МАРГИНАЛЬНЫМ РИСКОМ.

  Несмотря на все тяжелые условия, основная зона риска будет находиться на юго-западе и юге нашей территории. То, что рядом с суровым островом Святого Патрика, выглядит особенно сурово для Нижней долины Миссисипи. Параметры предварительно увеличены до умеренного риска.

  После этого наступит заминка, и около 18 марта у нас может быть несколько снегопадов / снегопадов с максимумами от 30 до 40 градусов с минимумом в 20 секунд.

  Не огорчайтесь, похоже, пара приятных всплесков тепла вернется БЫСТРО! Риск дождя и шторма увеличится в конце марта и продлится до начала апреля.

  Вероятность того, что это будет самое теплое начало апреля с 2010 или 2012 года, есть.

  Сильный погодный риск будет проблемой до начала апреля.

  Данные

  предполагают всплеск холода около 14 апреля с минимумом 28-32, который будет нашим последним таким периодом холода.

  Растительность будет довольно продвинута примерно на 1-1,5 недели вперед, возможно, к тому времени при расчете вероятных GDD (дней степени роста), но она не выглядит достаточно холодной, чтобы нанести ущерб, как в прошлом году.

  Особых побочных историй! Семь возлюбленных ~ Наша первая весна ~

  Эта страница содержит информацию о побочной истории — Семь возлюбленных в игре Epic Seven.Читайте дополнительную информацию, такую ​​как расписание событий, награды и советы по прохождению этапов этого события.

  
  Клубы Reignar находятся на грани краха. Студенческий совет начинает планировать фестиваль, на котором все клубы смогут продвигать себя.

  Особая история «Семь возлюбленных ~ Наша первая весна ~» Вторая неделя уже здесь!

  График
  25.02 (Чт) 3:00 ~ 3/18 (Чт) 02:59 UTC

  
  «Побочная история» состоит из восьми раундов.Чтобы закончить каждый раунд, вы должны достичь определенного параметра.

  Если вы очистите одну концовку, вы можете перейти к новому раунду. Параметры сбрасываются в начале каждого раунда.

  
  Каждую неделю будет выходить новая глава «Побочной истории».

  неделя	Маршрут	График
  1	Yuna / Pearlhorizon / Celine / Judith Route (Раунды 1 ~ 3)	25.02 (Чт) 03:00 UTC
  2	Маршрут Изерия / Ванда (раунды 4 ~ 6)	3/4 (чт) — после ТО
  3	Добавлен новый маршрут (раунды 7 ~ 8)	3/11 (Чт) 03:00 UTC

  Артефакт	Эффект
  XIV.Умеренность	Увеличено выпадение билетов на клубный фестиваль и временного следа на определенную сумму, в зависимости от ограничения лимита.
  Корзина Алексы	Увеличено количество выпадающих билетов на клубный фестиваль и печально выглядящего шоколада на определенную сумму, в зависимости от превышения лимита.
  Фиолетовый талисман	Увеличен выпадение Temporal Trace на определенную величину, в зависимости от Limit Break.

  Каждую неделю Side Story будет вводить новую валюту для использования в обменном магазине.

  неделя	Валюта	Как получить
  1	Билет на клубный фестиваль	Можно получить, завершив главы, не связанные с сюжетом, на 1-й неделе.
  2	Несчастный шоколад	Можно получить, завершив главы, не связанные с сюжетом, на 2-й неделе.
  3	Временной след	Можно получить, завершив главы, не связанные с сюжетом, на 3-й неделе.

  Эти валюты можно использовать в Магазине обмена для покупки наград, доступных в магазине.

  ПРИМЕЧАНИЕ : Эти валюты будут удалены, когда побочная история будет завершена.

  Каждую неделю вы будете получать разные наборы предметов на выбор.

  XIV. Умеренность

  Рейтинг	4 ★
  Категория	Общий

  Эффект навыка (базовый)
  После использования базового навыка дает союзнику барьер, эквивалентный максимум 5% максимального здоровья заклинателя на 2 хода, за исключением заклинателя с наименьшим здоровьем.Эффект умения этого Артефакта может применяться только к одному Герою в команде.
  Эффект навыка (макс.)
  После использования базового навыка дает союзнику барьер, эквивалентный максимум 10% максимального здоровья заклинателя на 2 хода, за исключением заклинателя с наименьшим здоровьем. Эффект умения этого Артефакта может применяться только к одному Герою в команде.

  XIV. Умеренность — Рейтинг и статистика

  И Люси.

  Сильные стороны

  • Имеет ограничение AoE
  • Высокая скорость для ткача душ
  • Подходит для охоты на Caides

  Слабость

  • Нет исцеления для ткача душ
  • S2 имеет долгое время восстановления.
  • 3-звездочные базовые характеристики

  Люси — Рейтинг и статистика

  Формат этого контента будет таким же, как и в режиме приключений, где вам нужно будет закончить этап, прежде чем перейти к следующему.

  Однако на некоторых этапах истории есть точка принятия решения, которая заблокирует вас в выборе определенного маршрута:
  
  После того, как вы выбрали, невыбранный вариант будет заблокирован до конца раунда. Не волнуйтесь, как только вы закончите раунд, вы можете вернуться на тот же перекресток и выбрать другой

  Не сюжетные этапы в каждой истории предлагают игроку 4 уровня сложности, чтобы получить Параметры и очистить сцену. Чтобы фармить как можно больше валюты побочного сюжета и получить как можно больше параметров с наименьшими затратами энергии, рекомендуется пройти адскую сложность.

  Первая страница

  .

  No related posts.