Как в акб повысить плотность: Повышение плотности электролита в АКБ

Как в аккумуляторе ПОДНЯТЬ ПЛОТНОСТЬ электролита самостоятельно❓

Поднять плотность в аккумуляторе в домашних условиях можно несколькими способами: полностью заменить старый электролит на новый либо восполнить заряд АКБ. Обе манипуляции следует проводить в хорошо проветриваемых помещениях с соблюдением техники безопасности. После завершения процедуры нужно откорректировать объем рабочего раствора, а затем произвести замер параметра плотности ареометром.

Почему падает плотность электролита?

Основные причины, по которым может упасть показатель уровня электролита в банках автомобильной аккумуляторной батареи (АКБ):

1. Разряд устройства. Как правило, разряжение в аккумуляторе автомобиля происходит в холодное время года, поэтому зимой используют специальные методы, позволяющие восстановить и поднимать уровень заряда. Проблема может проявляться в автомобильном аккумуляторе, который близок к естественному износу. При быстром разряде можно сделать вывод о падении пропорции рабочего раствора до критически низкого уровня. Проблема разряжения может быть связана с механическим повреждением устройства или неисправностью генераторной установки, в результате чего электросеть автомобиля питается от АКБ.
2. Выкипание рабочей жидкости в результате перезарядки аккумулятора. Если на устройство поступает постоянное напряжение, это приводит к разделению воды на кислород и водород. В результате при зарядке жидкость выкипает и уровень электролита снижается.
3. Постоянное добавление дистиллированной воды вместо химического раствора. Если долить жидкость единожды, то уровень плотности АКБ в машине упасть не должен, но постоянные доливания будут этому способствовать.

Как подготовить аккумулятор к восстановлению?

Перед тем, как восстановить на обслуживаемом аккумуляторе плотность электролита, необходимо выполнить ряд действий:

1. Производится демонтаж батареи с авто, для этого предварительно ослабляются клеммные зажимы устройства.
2. При наличии защиты выполняется ее снятие. Для этого потребуется гаечный ключ соответствующего размера.
3. С помощью отвертки или другого приспособления с плоским наконечником производится откручивание пробок на банках. Рекомендуется использовать защитные очки и перчатки, чтобы не допустить появления ожогов.
4. Пользователь выполняет диагностику объема рабочей жидкости в устройстве. Для легковых транспортных средств данный параметр должен составить около 1,5 сантиметров выше пластин. Диагностика плотности электролита должна производиться через 3 часа после подзарядки устройства либо примерно через 10 ч после остановки двигателя. Если уровень жидкости соответствует норме, то ареометр опускается в банки и с помощью груши производится набор небольшого объема воды.
5. В зависимости от температуры воздуха производится оценка полученных параметров. Проверка выполняется для каждой банки отдельно. В идеале данный показатель должен составить в диапазоне от 1.25 до 1.29 г/см3.

При подготовке аккумуляторной батареи необходимо учитывать следующие нюансы:

1. Перед открытием банок пользователю нужно произвести очистку корпуса устройства от загрязнений чистой ветошью. Это нужно сделать для того, чтобы при откручивании пробок грязь не попала внутрь батареи. В противном случае возможен полный выход устройства из строя.
2. Если диагностика будет выполняться без демонтажа батареи, то нужно убедиться в ее качественной посадке. Устройство не должно болтаться.
3. При подготовке аккумуляторную батарею нельзя переворачивать, поскольку это может привести к разрушению пластин, расположенных внутри. В результате АКБ полностью выйдет из строя без возможности восстановления.

Видео: руководство по использованию ареометра

Канал «Аккумуляторщик» в своем видеоролике подробно описал процесс подготовки аккумулятора и рассказал об использовании ареометра.

Как самостоятельно увеличить плотность электролита?

Для правильного проведения процедуры необходимо учитывать следующие нюансы:

1. При приготовлении нового рабочего раствора в дистиллированную воду добавляется кислота, а не наоборот. В противном случае начнется кипение жидкости.
2. Пользователю понадобятся точные расчеты нужного объема кислоты, так как в процессе заряда уровень плотности электролита увеличивается.

Важно знать

На новом аккумуляторе самостоятельно поднимать плотность электролита не рекомендуется, поскольку это приведет к более быстрому разряду устройства. Повышенный рабочий параметр негативно повлияет на функциональность батареи.

Приступать к процедуре необходимо с соблюдением техники безопасности, так как электролит – это ничто иное, как кислотный раствор, поэтому:

• наденьте резиновые перчатки;
• максимально обезопасьте себя от попадания электролита на одежду и тем более кожу;
• используйте защитные очки и респиратор.

Что понадобится?

Чтобы правильно повысить плотность аккумуляторной батареи перед зимним периодом, нужно подготовить следующие материалы и инструменты:

• ареометр;
• мерный стакан или другая аналогичная емкость;
• отдельная емкость для разведения нового рабочего раствора;
• клизма-груша;
• корректирующий раствор либо кислота;
• дистиллированная вода.

Пошаговая инструкция по повышению плотности электролита добавлением жидкости

Правильный способ для увеличения параметра плотности электролита батареи:

1. Перед тем, как в аккумуляторе поднять плотность, производится снятие аккумуляторной батареи с автомобиля. Для этого отключаются клеммные зажимы и производится демонтаж фиксирующей пластины. Действия по выполнению задачи осуществляются с применением гаечного ключа.
2. С банки аккумуляторной батареи отбирается небольшой объем рабочего раствора. Для этого используется ареометр.
3. Вместо изъятого объема жидкости в банку добавляется корректирующий раствор вещества при необходимости увеличения плотности. В случае, если требуется понизить этот параметр, используется дистиллированная вода с плотностью 1,00 г/см3.
4. Затем аккумулятор ставится на подзарядку. На протяжении последующих 30 минут производится подзарядка устройства номинальным током. Такие действия позволят залитому корректирующему раствору смешаться с рабочей жидкостью.
5. Аккумуляторная батарея отключается от зарядного прибора на один-два часа. Это позволит плотности в банках «выровняться» и снизиться уровню температуры. Также за два часа из банок выйдут все пузырьки, благодаря чему исключается вероятность погрешности при контрольном замере.
6. Повторно производится диагностика уровня плотности электролита, при необходимости процедура повторяется заново. Также при необходимости в банки добавляется жидкость для увеличения или уменьшения параметра, а затем заново производится замер.

Важно знать

Надо учитывать, что разница параметра плотности между банками должна составить не более 0,01 г/см3. Если при выполнении задачи не удалось достигнуть такого результата, то требуется выполнить дополнительную, «выравнивающую» зарядку на протяжении 1-2 часов. При этом параметр тока должен составить в 2-3 раза меньше номинального.

Формула расчета количества жидкости для корректировки плотности электролита

где:

• Vэ — объём удаляемого из банки электролита, см3;
• Vб — объём электролита в одной банке, см3;
• ρн — начальная плотность электролита до корректировки, г/см3;
• ρк — конечная плотность, которую надо получить, г/см3;
• ρд — плотность доливаемой жидкости, (вода — 1,00 г/см3 или корректирующий электролит — * г/см3).

Важно знать

При использовании данной формулы объёмы удаляемого и добавляемого электролитов равны.

Таблица: корректировка плотности в АКБ

Как поднять зарядным устройством?

Для повышения плотности зарядным оборудованием выполняются следующие действия:

1. Аккумуляторная батарея доводится до полной зарядки. Предварительно нужно снять устройство с автомобиля и подключиться к оборудованию, которое будет заряжать АКБ, с соблюдением полярности. Сначала выполняется соединение с прибором, а затем его подключение к сети.
2. В процессе восстановления заряда пользователю нужно следить за состоянием электролита. После того, как жидкость начала кипеть, необходимо снизить параметр силы тока до 1-2 ампер. При кипении воды происходит ее испарение, это приводит к тому, что плотность концентрации электролита начинает повышаться.
3. Время испарения жидкости определяется конкретной ситуацией, в некоторых случаях на это может потребоваться более 24 часов.
4. После снижения уровня воды в банках производится добавление электролита и замер плотности.
5. При необходимости производится повторение данной операции.

Руководство по повышению плотности в необслуживаемом аккумуляторе

Действия по повышению плотности выполняются аналогичные, разница заключается в получении доступа к рабочей жидкости:

1. В необслуживаемых устройствах корпус полностью закрыт, поэтому пользователю надо демонтировать батарею и снять с нее наклейку. Крышку аккумулятора снимать не нужно, поскольку установить ее обратно будет сложно.
2. Нужно сделать отверстие в крышке, используя шило или дрель. Оно должно быть небольшим, поскольку придется впоследствии его запаивать.
3. Используя одноразовый шприц в АКБ добавляется дистиллят или корректирующий электролит в зависимости от того, что нужно сделать с рабочим параметром. Следует добавлять по 5 мл жидкости. Рекомендуется использовать банку батареи, в которой расположен индикатор плотности. Если индикатор стал черного либо зеленого цвета, то в аккумулятор нужно добавить еще 20 мл жидкости.
4. Для определения уровня рабочего раствора игла опускается в банку, а шток подтягивается в обратном направлении. Затягивая рабочий раствор в шприц, рекомендуется отмечать уровень с помощью маркера. Если в батарее применяется пластик светлого оттенка, то уровень жидкости можно определить на просвет или замерить с помощью линейки. Остальные банки доливаются до уровня, который должен составить на 1,5-2 см выше поверхности пластин.
5. После выполнения задачи отверстия нужно заделать герметиком либо специальными резиновыми пробками. Затем аккумулятор следует осторожно потрясти, чтобы перемешать электролит. Но действовать надо аккуратно, чтобы не повредить пластины.

Как увеличить плотность, если она ниже 1,18

Если рабочее значение плотности составил менее 1,18 г/см3, описанные способы не позволят решить проблему и пользователю потребуется полностью сливать кислоту из банок.

Алгоритм действий при этом будет такой:

1. Электролит откачивается из аккумуляторной батареи, насколько это возможно (для откачки можно использовать грушу с клизмой).
2. Аккумулятор осторожно переворачивается без резких движений. Это позволит предотвратить возможное осыпание пластин. В дне устройства надо просверлить отверстия в каждой банке с помощью дрели. Эти действия рекомендуется выполнять в емкости, к примеру, миске или тазике.
3. Затем аккумулятор устанавливается в вертикальное положение и из него сливаются остатки рабочего раствора.
4. Производится промывка батареи с помощью дистиллята.
5. Отверстия в дне аккумулятора запаиваются, на этом этапе важно убедиться в герметичности устройства, чтобы не допустить дальнейшей утечки жидкости. Производится заливка нового раствора в батарею.

Важно знать

Пластик для запаивания отверстия в аккумуляторе должен быть максимально устойчивым к воздействию серной кислоты. Кроме того, если цвет электролита коричневый или черный, восстанавливать батарею не имеет смысла. Темный оттенок свидетельствует об осыпании пластин или о разрушении батареи.

Видео: самостоятельное увеличение плотности электролита

Канал «Denis МЕХАНИК» в своем видеоролике подробно изложил процесс зарядки аккумуляторной батареи и добавления электролита, а также увеличения его плотности.

Эксплуатация, зарядка, хранение аккумуляторной батареи

Содержание

1. Техническое отступление
2.Основные характеристики аккумуляторных батарей

2.1. Расход воды
2.2. Долговечность батареи
2.3. Рекомендации по эксплуатации

3. Терминология
4. Маркировка АКБ
5. Выбор и покупка АКБ
6. Установка АКБ
7. Рекомендации по эксплуатации и обслуживанию

7.1. Обслуживание АКБ в процессе эксплуатации
7.2. Продление жизни новой батарее
7.3. Зарядка аккумулятора зарядным устройством

8. Особенности эксплуатации АКБ в зимний период

8.1. Прикуривание от другого автомобиля

9. Особенности эксплуатации АКБ в летний период
10. Вопросы безопасности
11. Хранение аккумуляторной батареи
12. Приложения

12.1. Реанимация аккумулятора
12.2. Ещё несколько способов, основанных на использовании электрического тока

1. Техническое отступление

2. Основные характеристики аккумуляторных батарей

Е = 6 * (0,84 + р) , где Е — ЭДС аккумулятора , (В) р — приведенная к температуре 5°С плотность электролита , г/мл

2.1. Расход воды
Показатель, имеющий непосредственное отношение к степени обслуживаемости батареи. Определяется в лабораторных условиях. Батарея считается необслуживаемой, если она имеет очень низкий расход воды в эксплуатации. Необслуживаемые батареи не требуют доливки дистиллированной воды в течении года и более при условии исправной работы регулятора напряжения.
На расход воды прямое влияние оказывает процентное содержание сурьмы в свинцовых решетках пластин. Как известно, сурьма добавляется для придания пластинам достаточной механической прочности. Однако у каждой медали есть обратная сторона. Сурьма способствует расщеплению воды на кислород и водород, следствием чего является выкипание воды и снижение уровня электролита. В батареях предыдущего поколения содержание сурьмы доходило до 10%, в современных этот показатель снижен до 1.5 %.
Панацею от этой беды фирмы видят в освоении т.н. гибридной технологии — замене сурьмы в одной из пластин на кальций. Кальций в решетке является веществом нейтральным по отношению к воде, не снижая при этом механической прочности решеток. А потому разложения воды не происходит и уровень электролита остается неизменным.
Преимущества «кальциевых» АКБ — можно устанавливать в местах , не не требующих удобного доступа для обслуживания. Меньше вероятность выхода из строя из-за коррозии решеток электродов. Лучшие стартерные характеристики.
Недостаток «кальциевых» АКБ — при глубоких разрядах происходит образование нерастворимых солей кальция, и емкость АКБ необратимо теряется. Производители АКБ пытаются устранить этот недостаток добавлением в АКБ серебра и др. компонентов, результат пока окончательно не ясен.

2.2. Долговечность батареи
Средний срок службы современных АКБ при условии соблюдения правил эксплуатации — а это недопущение глубоких разрядов и перезарядов, в том числе по вине регулятора напряжения — составляет 4-5 лет.
Наиболее губительными для батарей являются глубокие разряды. Оставленные на ночь включенными световые приборы, либо другие потребители способны разрядить ее до плотности 1.12 — 1.15 г/см3, т.е. практически до воды, что приводит к главной беде аккумуляторов — сульфатации свинцовых пластин. Пластины покрываются белым налетом, который постепенно кристаллизуется, после чего батарею практически невозможно восстановить. Отсюда вытекает главный вывод — необходимо постоянно следить за состоянием батареи, периодически замерять плотность электролита. Особенно актуально это в зимнее время. Следует отметить, что сульфатация в определенных пределах — явление нормальное и присутствует всегда. (Вспомните — на основе теории двойной сульфатации построен принцип работы батарей). Но при малом разряде и последующей зарядке батарея легко восстанавливается до исходного состояния. Это возможно и при глубоком разряде батареи, но только в том случае, если следом сразу, же последует заряд. Если же разряжать батарею длительное время, не давая ей «подпитки», то падение плотности, ниже критического значения неизбежно приводит к образованию кристаллов сульфата свинца, не вступающих в реакцию ни при каких обстоятельствах. А это означает, что начался необратимый процесс сульфатации.
Не менее опасен для батареи и перезаряд. Это происходит при неисправном регуляторе напряжения. При этом электролит начинает «кипеть» — происходит разложение воды на кислород и водород, и понижение уровня электролита. Вот почему необходимо следить за зарядным напряжением. Естественно, это не составляет труда, если на панели приборов присутствует вольтметр. Ну а если его нет? В этом случае также можно довольно просто оценить зарядное напряжение. Для этого запустите и прогрейте двигатель, установив средние обороты и подключите тестер (в режиме вольтметра) между «+» и «массой» аккумуляторной батареи. Нормальный зарядный режим батареи обеспечивается в диапазоне 14±0.5В. Если напряжение меньше — стоит проверить натяжение ремня, надежность контактных соединений цепей системы электроснабжения. Если же это не помогает — неисправность нужно искать в регуляторе напряжения. Впрочем, точно также вина ложится на регулятор, если напряжение превышает 14.5В.
В последнее время широкое распространение получили сепараторы карманного типа — т.н. конвертные сепараторы. Их название говорит за себя — в эти конверты помещают одноименно заряженные пластины. Такая конструкция увеличивает срок службы батареи, так как осыпающаяся в процессе эксплуатации активная масса остается в конверте, тем самым предотвращается замыкание пластин.

2.3. Рекомендации по эксплуатации
Батарея, не эксплуатировавшаяся в течении длительного времени (4-5 мес.) нуждается в подзарядке. Связано это с тем, что батареям свойственно такое явление, как саморазряд. На графиках рис.2,3 показаны характеризующие саморазряд величины для различных батарей. В первом случае — это снижение плотности от времени хранения, во втором — падение напряжения.

Нужно сказать, что использование данного алгоритма оправдано лишь для облегчения процедуры, но ни в коей мере не избавляет от контроля за ходом зарядки. Процесс заряда, а особенно его окончание Вам необходимо контролировать самому, дабы не прозевать начало бурного кипения.
Другой вариант — использование для этих целей автоматических зарядных устройств, отличающихся тем, что зарядка идет при постоянном напряжении, но автоматически изменяющемся в зависимости от степени заряженности батареи токе. При этом зарядное устройство перестает давать ток, если батарея полностью заряжена. Принцип, используемый в подобных устройствах аналогичен зарядке от генератора на автомобиле.
Для примера определим время зарядки батареи ёмкостью 55 Ач током в 5А, плотность которой составляет 1.25 г/см3. Как видно из графика, при данной плотности батарея разряжена на 25%, что означает потерю ёмкости на величину

Таблица 1
Модель автомобиля…………………..2101-2106……2108-2109……2110
ток отдачи на холостом ходу…………….16………………24…………..35
ток отдачи на номинальных оборотах 42……………….55…………..80

Как видно из таблицы, на последних моделях автомобилей Волжского автозавода устанавливаются генераторы, имеющие характеристики тока отдачи, в два раза превосходящие по величине характеристики генераторов первых моделей.

И наконец, примерное потребление энергии автомобильными потребителями:

Таблица 2
потребитель……….ток, А (приблизительно)
зажигание……………..2
габариты……………….4
ближний свет…………9
дальний свет………..12
обогрев стекла……10-11
стеклоподьемник…20-30

вентилятор отопителя:
1-я скорость…………5-7
2-я скорость……….10-11
стеклоочистители…3-5
магнитола…………….5
ИТОГО……………….38-48

Таким образом, оставленные включенными габариты за три часа «съедят» 4А х 3ч= 12 Ач ёмкости батареи, что соответствует разряду приблизительно на 20%. Это не страшно для одного раза. Однако повторив это ещё раз, Вы уже рискуете не завести свою машину, особенно, если дело происходит зимой, т.к. разряд составит порядка 40% (тем более, что к тому же зимой батареи, как правило, эксплуатируются заряженными далеко не на 100%).
Аналогично можно прикинуть, что Вы имеете при продолжительной работе двигателя на холостом ходу. Как уже показано выше, ток отдачи генератора автомобиля ВАЗ-2108 на холостом ходу составляет 24А. Вычитаем из этой величины 2А, необходимые для обслуживания системы зажигания. Остается 22А. Используя таблицу 2, нетрудно прикинуть, что можно включать с тем, чтобы хоть немного досталось бы и аккумулятору (при этом помните про КПД зарядки, составляющий 50%).
Для владельцев иномарок с автоматической коробкой передач картина ещё более сложная. Обычно, стоя в пробке или на светофоре, Вы не переключаетесь на нейтраль, а давите ногой на тормоз. Это понижает обороты двигателя от стандартных 800-900 об./мин. до 600-700 об./мин., что, соответственно понизит ток, выдаваемый генератором, а стоп-сигналы добавят ещё пару ампер потребления тока. Да и обогрев заднего стекла у немцев, например, существенно мощнее, чем у отечественных автомобилей.
Следует знать, что зимние условия эксплуатации автомобиля в принципе очень тяжелы для аккумуляторной батареи. Наверняка будут полезны следующие данные. Результаты проводимых в ГДР исследований говорят о том, что при эксплуатации автомобиля в очень тяжелых условиях (испытания по так называемому режиму «город-зима-ночь») аккумулятор получает порядка 1Ач в час

3. Терминология

4. Маркировка АКБ

5. Выбор и покупка АКБ

6. Установка АКБ

7. Рекомендации по эксплуатации и обслуживанию

7.1. Обслуживание АКБ в процессе эксплуатации сводится к проверке и приведению в соответствие с требованиями: уровня и плотности электролита; чистоты и надежности крепления электрических соединений батареи с корпусом автомобиля, параметров электрооборудования, крепления батареи. Необходимо также следить за правильным натяжением ремня генератора, очищать и смазывать выводы и клеммы, содержать батарею в чистоте. Протирайте верхнюю поверхность водным раствором питьевой соды. Доведение плотности электролита до требуемой производится путем заряда батареи от стационарного зарядного устройства.
Значение зарядного тока в амперах (А) не должно превышать 1/10 ёмкости батареи (упрощенно).

7.2. Продление жизни новой батарее
Коротко об этом сказать трудно. В первую очередь, следует залить электролит, точно соответствующий не только климатической зоне, но и сезону эксплуатации. Если батарея будет работать только в теплое время года, то плотность электролита может быть 1.20 г/см3, а если до -15°С — 1.24 г/см3 и т.д. Такая точность, безусловно, снизит скорость сульфатации пластин, следовательно, увеличит долговечность батареи.
На срок службы АКБ значительно влияет средняя степень заряженности, которая зависит от исправности реле-регулятора. Необходимо, чтобы эта величина поддерживалась не ниже 75%.

справка:
Установлено, что отклонение регулируемого напряжения на 10…12% вверх или вниз от оптимального сокращает срок службы батареи в 2…2.5 раза.

Во-первых, отрегулируйте двигатель так, чтобы он легко заводился с пол-оборота. Это предохранит АКБ от глубокого разряда. При пуске двигателя стартером через аккумуляторную батарею проходит ток в несколько сот Ампер, что не способствует ее долговечности. Поэтому, чем легче пуск двигателя, тем лучше для АКБ: она прослужит дольше.

справка:
Сокращение времени работы стартера вдвое при шести-восьми ежедневных пусках повышает срок службы аккумуляторной батареи приблизительно в 1.5 раза.

Во-вторых, отрегулируйте при необходимости реле-регулятор, чтобы напряжение было в пределах 13.8…14.4В. Это одно из важнейших условий. В-третьих, никогда не позволяйте снизиться уровню электролита в банках ниже требуемого.

справка:
Несвоевременная доливка в аккумуляторы дистиллированной воды может снизить срок службы батареи на 30%.

Эти простые советы, продлят жизнь АКБ.

Кроме этого, специалисты советуют при наличии зарядного устройства при любой возможности (например, на ночь) ставить аккумуляторную батарею на подзарядку малым током — около 1…2А. Для этого можно АКБ не снимать с автомобиля. Только эта операция, если ее проделывать регулярно, не реже одного раза в месяц, увеличивает срок службы батареи, по крайней мере, на год.

7.3. Зарядка аккумулятора зарядным устройством
Ну а теперь как заряжать? Зарядные устройства бывают с ручной и автоматической регулировкой (Орион PW-270, Орион PW-320) или автоматические (все остальные зарядные устройства Орион). Перед зарядкой необходимо открыть все газовые каналы: вывернуть пробки, снять крышки банок.
При зарядке важны три параметра: напряжение, ток зарядки и время. Когда аккумулятор частично процентов на 25 разряжен, то начальный ток заряда при включении выпрямителя может резко скакнуть вверх. Отрегулируйте его на зарядный ток около 1/10 ёмкости аккумулятора или меньше (это общепринятое правило заряда кислотных батарей). Т.е., если у Вас батарея имеет маркировку 55Ah — выставляем ток около 5.5А.
Если необходимо зарядить батарею в кратчайшее время, можно выставить и больший ток. В соответствии с законом Вудбриджа который гласит: сила зарядного тока (в амперах) не должна превышать величину заряда (в ампер-часах), недостающего до полной ёмкости акуммулятора. При этом зарядное устройство должно автоматически снижать ток при повышении напряжения или выключаться при достижении порогового напряжения на батарее. В противном случае (если ЗУ этого не делает) необходимо непрерывно контролировать зарядный ток и напряжение в ручную.
Далее в процессе зарядки напряжение будет расти, а ток уменьшаться. Считается, если ток не уменьшается в течение последних 2-3 часов, то аккумулятор заряжен. Важно помнить, что нельзя вести заряд большим током более 25 часов. Электролит сильно нагреется и выкипит, пластины от нагрева может повести и они замкнут друг на друга. Обычно нормальное время полного заряда около 15 часов.
Иногда необходимо выровнять плотность небольшим током. Например, если плотность электролита в разных банках 1.23, 1.25. Включив зарядное устройство, устанавливаем ток зарядки порядка 1-2А. Данное значение у разных АКБ- разное и зависит от многих факторов: конструкции, пассивационного материала пластин, состояния батареи и т.д. Время такой зарядки до двух суток. Особенно это необходимо делать после того, как аккумулятор разряжен в ноль бесплодными попытками завести двигатель. При чём, делать это надо сразу, пока не началась сульфатация пластин.
Батареи, исключающие долив воды, должны заряжаться только устройствами с автоматическим поддержанием зарядного напряжения. Несоблюдение этого условия приведет к снижению их срока службы. Конкретные требования по режиму заряда, эксплуатации и обслуживанию должны быть изложены в инструкции или гарантийном талоне, прилагаемом к батареям.
В настоящее время разные производители обозначают разное напряжение окончания заряда. Как правило, оно составляет от 15 до 16В (для батарей устаревших конструкций, с применением в качестве пассивирующего материала сурьмы — меньше). На самом деле, порог ограничения напряжения автоматического зарядного устройства 15 или 16 вольт (для батареи с прописанными, для полного заряда, 16ю вольтами, например Varta) влияет только на время заряда последних 2-4% емкости.
Для доведения уровня электролита до нормы недопустимо использовать электролит! В аккумуляторную батарею доливают только дистиллированную воду. Не используйте воду сомнительного происхождения. При частом выкипании проверьте электрооборудование автомобиля.
Необходимо знать, что при сильном снижении уровня электролита внутри корпуса аккумулятора может образоваться опасная концентрация газовой смеси. Чтобы исключить вероятность взрыва, нельзя подносить к батарее открытое пламя (даже сигарету) и допускать искрение электроконтактов. Системы газоотвода некоторых современных батарей более взрывобезопасны. В средней полосе России АКБ не требуют корректировки плотности электролита при смене сезонов.
Перед зимней эксплуатацией автомобиля сделайте обслуживание не только аккумуляторной батареи (см. выше), но и систем, влияющих на запуск двигателя. Обязательно залейте моторное масло, соответствующее сезону. Для облегчения запуска двигателя в сильные морозы занесите батарею на несколько часов в теплое помещение.
Перед длительной зимней стоянкой также обслужите батарею, но не храните ее в теплом помещении, а оставьте на автомобиле со снятыми клеммами. Чем ниже температура, тем меньше скорость ее саморазряда.
Недопустимо оставлять на морозе разряженную батарею. Электролит низкой плотности замерзнет, и кристаллы льда приведут ее в негодность. Плотность электролита разряженного аккумулятора может снизиться до 1,09 г/см3, что приведет к его замерзанию уже при температуре -7°С. Для сравнения – электролит плотностью 1.28 г/см3 замерзает при t=-65°С.
Опрокидывание аккумуляторной батареи и слив электролита могут привести к замыканию пластин и выходу ее из строя.
Для борьбы с паразитными токами утечки введите себе привычку вытирать корпус батареи насухо от всякой нечисти. Если совсем в лом, то хотя бы делайте чистый круг вокруг плюсовой клеммы, чтобы разорвать паразитные электрические связи. Ну, а если Вы любите свою машину, то разведите немного соды в воде и протрите всю поверхность корпуса батареи и вытрете ее насухо. Все тряпки, которые прикасались к аккумулятору выбросить немедленно! А заодно проверите крепление батареи, уровень электролита и его плотность. Времени это займёт минут 10-15, а сэкономить может часы и кучу нервов.

8. Особенности эксплуатации АКБ в зимний период

8.1. Прикуривание от другого автомобиля
Для российских автовладельцев нормальная ситуация, когда сосед просит «прикурить» его аккумулятор. Для этой нехитрой процедуры помимо автомобиля с заряженным аккумулятором, необходимы ещё и правильные провода. Не забываем, что по этим проводам у нас потечёт около 200 ампер!

8.2 Запуск машины при помощи предпускового зарядного устройства Вымпел. Подключаете устройство, выставляете максимальный ток 18А, оживляете акумулятор в течении 10-15 мин. Затем не отключая зарядного устройства пробуете завести. Если не получилось повторяете попытку заново.

9. Особенности эксплуатации АКБ в летний перио

Как сохранить свой аккумулятор летом?
Во-первых, следите за уровнем электролита и регулярно доливайте дистиллированную воду. Во-вторых, не оставляйте батарею незаряженной. В-третьих, следите за чистотой корпуса. В-четвертых, следите за состоянием электрической системы автомобиля. Неисправный стартер и генератор совершенно незаметно “подготовят” батарею к зиме и с первыми морозами она откажет.
Если вы планируете заменить аккумулятор, лучше не ждать до осени. В сезон выбор значительно меньше, цены выше, а желающих больше. В любом случае потребуется помощь подготовленного продавца-консультанта. Летом он сможет больше уделить вам времени.

10. Вопросы безопасности

11. Хранение аккумуляторной батареи

Справка
Для приготовления 5-процентного раствора борной кислоты необходимо в 1 литре дистиллированной воды, нагретой до 50…60°С, растворить 50г борной кислоты. Раствор заливают в аккумуляторы при температуре 20…30°С.

Хранить батарею надо при температуре не ниже 0°С, поскольку заливаемый 5-процентный раствор борной кислоты может замерзнуть. А для ввода такой батареи в действие из нее выливают раствор борной кислоты в течение 15…20 минут и сразу же заливают сернокислый электролит плотностью 1.38…1.40 г/см3 для нашей зоны. После 40-минутной пропитки пластин электролитом АКБ можно устанавливать на автомобиль, если плотность электролита не уменьшилась ниже 1.24…1.25 г/см3. Если она стала ниже, следует откорректировать плотность отбором слабого раствора и добавлением электролита плотностью 1.40 г/см

12. Приложения

Начнем с конца списка. (п.3) При замыкании пластин ни в коем случае не пытайтесь его заряжать! Начинаем промывку дистиллированной водой. Не бойтесь переворачивать и трясти аккумулятор, хуже уже не будет. Промывайте его до тех пор, пока не перестанет вымываться угольная крошка (надеюсь, этот момент наступит, иначе прекратите этот мазохизм). При промывке часто замыкание пластин устраняется, и мы переходим от пункта (3) к пункту (2). После промывки и вытряхивания всякого мусора из недр аккумулятора приступаем к пункту (1), а именно к устранению отложений солей на пластинах аккумулятора. Следуйте инструкциям к присадке. Мой опыт может отличаться от того, что вы прочтёте в инструкции. Далее я делаю так:
1) Заливаем аккумулятор электролитом номинальной плотности (1.28 г/см3).
2) Добавляем присадку, исходя из объёма аккумулятора (см. инструкцию)
3) Даём электролиту выдавить воздух из секций, а присадке — раствориться в течении 48 часов (!), при необходимости доливаем электролит до номинального уровня. Кстати, присадку можно растворить в электролите до заливки в аккумулятор, если, конечно, она хорошо растворяется.
4) Подключаем зарядное устройство (не забудьте снять пробки!). НО МЫ НЕ БУДЕМ ЕГО ЗАРЯЖАТЬ! НЕ СЕЙЧАС! Сначала мы будем гонять его по циклу «зарядка-разрядка», иначе «тренировка», то есть заряжать и разряжать его, пока не восстановится нормальная ёмкость. Выставляем ток зарядки в районе 0.1- 0.2 А и следим за напряжением на клеммах. Не давайте электролиту кипеть или нагреться! Если необходимо, уменьшите зарядный ток, пузырьки газа и перегрев разрушают аккумулятор! Заряжайте, пока напряжение на клеммах аккумулятора не достигнет 2.3 — 2.4В на каждую секцию, т.е. для 12-вольтового аккумулятора — 13.8-14.4 В.
5) Уменьшаем зарядный ток вдвое и продолжаем зарядку. Зарядку аккумулятора прекращаем, если в течении 2 часов плотность электролита и напряжение на клеммах остаются неизменными.
6) Доводим плотность до номинальной доливкой электролита повышенной плотности (1.4) или дистиллированной воды.
7) Разряжаем аккумулятор через лампочку током примерно в 0.5А до падения напряжения на клеммах до 1.7В на элемент. Для 12-вольтового аккумулятора эта величина составит 10.2В, для 6-вольтового 5.1 соответственно. Из имеющихся величин тока разряда и времени разряда вычисляем ёмкость нашего аккумулятора. Если она ниже номинальной (4 ампер-часа), то:
 Повторяем цикл заряда с начала до тех пор, пока ёмкость аккумулятора не приблизится к номинальной.
9) Добавляем в электролит ещё немного присадки и закрываем отверстия аккумулятора. ВСЁ!!! Мы имеем на руках рабочий аккумулятор, который, иногда способен проработать дольше китайского!

Дальше обращаемся с аккумулятором, как положено.

12.2. Ещё несколько способов, основанных на использовании электрического тока.

Способ первый — простой. Электролит заменить дистиллированной водой и зарядить аккумулятор или батарею очень небольшим (примерно 0.01 ёмкости) током. При этом в банках степень сульфатации снижается и образуется электролит, который заменять не нужно. После двух часов зарядки ее прекращают на такое же время. А затем снова повторяют.
Доказано, что после одного-трех таких циклов степень сульфатации резко снижается.

Второй способ — наиболее трудоемкий, но в безвыходном положении его тоже можно применить. Он химический, включает следующие операции: заряд батареи в течение 2…3 часов, слив электролита из банок, двух-трехкратная их промывка дистиллированной водой, заправка 2.5-процентным (25 г на 1 л) раствором питьевой соды и выдержка в течение 2…3 часов, слив раствора, заправка 2…3-процентным раствором повареной соли, заряд батареи в течение 1ч, слив раствора, промывка 4-процентным раствором питьевой соды, полный (из расчета 150-процентной ёмкости) заряд батареи, третья промывка банок, заправка их электролитом, полный (150-процентной ёмкости) заряд батареи.

Структурные данные из липидно-бислойных нанодисков связывают режимы связывания α-синуклеина с мембраной с образованием амилоидных фибрилл

αS-мембранно-модулированная агрегация из-за заряда липида состава, мы записали серию спектров двумерной поперечной релаксации ЯМР в растворе с оптимизацией спектроскопии (TROSY) -гетероядерной одноквантовой когерентности (HSQC), сохраняя молярное соотношение одна молекула αS на листок мембраны (рис.1а). В присутствии НА, содержащих только липиды 1,2-димиристоил-

Содержание заряда липидов модулирует режимы связывания αS мембраны, и разные режимы связывания по-разному влияют на агрегацию αS. a ЯМР [ ¹⁵ N- ¹ H] -TROSY-HSQC спектры [ ¹⁵ N] -αS (50 мкМ) в отсутствие (серый цвет) или в присутствии 25 мкМ НА, содержащих увеличивающуюся количество анионного липида POPG, дополненного цвиттерионным липидом DMPC (0% POPG (черный), 25% POPG (голубой), 50% POPG (синий), 75% POPG (темно-синий) и 100% POPG (фиолетовый)) ).Указаны выбранные присвоения остатков, соответствующие различным образом затронутым частям αS. Соответствующие профили ослабления ЯМР, то есть соотношение объемов пиков в присутствии и отсутствии НА, нанесены на график в зависимости от первичной последовательности αS для ацетилированного b и неацетилированного c αS. d Молекулярная модель, визуализирующая постепенное связывание различных частей αS с НА с увеличением содержания заряда. Белые стрелки и прозрачная окраска указывают на области αS, которые испытывают промежуточное затухание ЯМР-сигнала, указывающее на множественные (динамические или статические) состояния. e Анализ агрегации αS (нормализованная флуоресценция ThT) в отсутствие и в присутствии НА с указанным содержанием POPG для ацетилированного αS (концентрация αS и НА идентична данным ЯМР в a — c , данные трех измерений до достижения показаны насыщенность и их соответствующие подгонки, цветовой код как в a — c )

При 50% -ном содержании заряда область, содержащая остатки 38–60, также постепенно начинает взаимодействовать. Аминокислоты 60–98, приблизительно соответствующие склонному к агрегации неамилоидному β компоненту (область NAC), проявляют некоторые взаимодействия с мембранами, содержащими 75% анионных липидов, и сильно взаимодействуют при 100% содержании анионных липидов.На регион 98–120 (частично) влияет только 100% чистый заряд. Наконец, последние 20 C-концевых остатков никогда не обнаруживают какого-либо взаимодействия с мембраной (см. Рис. 1d для модели различных способов связывания). Эти данные в значительной степени согласуются с преимущественно электростатической моделью ⁴⁴ (первые 60 остатков показывают чистый положительный заряд, последние 40 остатков имеют чистый отрицательный заряд, а область NAC в основном гидрофобна), а также динамику трех областей. модель сообщается до использования внедорожников ²³ .

Интересно, что сравнение с ранее опубликованными данными о внедорожниках, которые наблюдают аналогичные отрицательные зарядозависимые режимы связывания для связанного везикулами αS с использованием электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ЯМР ^26,45 , предполагает, что такие факторы, как кривизна мембраны, потенциальная нестабильность липосом или физические границы, вводимые белками каркаса, которые должны предотвращать образование полностью вытянутой α-спирали αS на поверхности мембраны, не оказывают большого влияния на обнаруженную мембранную ассоциацию αS (более подробно см. ниже обсуждение режимов привязки; также см. дополнительное примечание 1 для более подробного обсуждения стабильности ND).

Используя флуоресценцию тиофлавина T (ThT) в качестве репортера образования фибрилл, мы также измерили кинетику агрегации αS в отсутствие и в присутствии различных составов НА (рис. 1e). Эти анализы агрегации регистрировали с использованием идентичных концентраций белка и ND, а также условий буфера, которые использовались для измерений ЯМР, облегчая прямое сравнение между режимами связывания с мембраной и их последствиями для агрегации белка. Примечательно, что, если не указано иное, была выбрана установка для анализа агрегации, которая в основном сообщает о последствиях взаимодействий ND с липид-независимым путем агрегации αS ^46,47,48,49 (более подробную информацию см. В разделе «Методы»).

Интересно, что несмотря на то, что данные ЯМР демонстрируют взаимодействие, присутствие НА вплоть до содержания анионных липидов 50%, по-видимому, не влияет на кинетику агрегации ацетилированного αS. При увеличении содержания отрицательного заряда до 75% полупериод агрегации немного увеличивается (рис. 1e, темно-синий), и обнаруживается сильный эффект ингибирования агрегации в присутствии НА со 100% анионными липидами (рис. 1e, фиолетовый ). Сравнение кинетических данных ThT с обнаруженными ЯМР способами связывания αS с мембранами с разным зарядом позволяет связать молекулярные детерминанты мембранной ассоциации с их возможным влиянием на агрегацию αS.Одна из наиболее ярких взаимосвязей заключается в том, что взаимодействие αS с ND, содержащим до 50% отрицательно заряженных липидов, не затрагивает область NAC, и что в тех же условиях в анализах ThT не обнаружено заметного влияния на агрегационное поведение (ацетилированного) αS. . При дальнейшем увеличении плотности заряда выше 50% отрицательно заряженных липидов данные ЯМР показывают сначала частичный (75% POPG, рис. 1a – c, темно-синий), а затем полный (100% POPG, рис. 1a – c, фиолетовый) ослабление сигнала в области NAC.Это мембранное взаимодействие области NAC коррелирует с небольшим ингибирующим эффектом 75% заряженных ND на агрегацию αS (рис. 1e темно-синий) и очень сильным ингибирующим эффектом 100% заряженных ND (рис. 1e, фиолетовый). Таким образом, наши данные убедительно свидетельствуют о том, что для тестируемых условий (высокое содержание анионных липидов и высокое соотношение липидов к αS) мембранная ассоциация области NAC защищает αS от агрегации.

Связанное с ND состояние αS

Примечательно, что, несмотря на принципиальную возможность ³⁴ , мы не смогли обнаружить связанную с ND конформацию αS с помощью ЯМР в растворе (см. Дополнительный рис.3 и дополнительное примечание 2 для более подробного обсуждения). Для того чтобы получить представление о конформации αS, связанной с НА, мы использовали твердотельный ЯМР с вращением под магическим углом. Кроме того, мы воспользовались очень низкими температурами (100 К), используемыми в динамической поляризации ядер (ДПЯ), чтобы дополнительно исключить обменные процессы и повысить чувствительность эксперимента. Чтобы избежать проблем перекрытия сигналов, возникающих из-за сильного неоднородного уширения линий, часто наблюдаемого в этом диапазоне температур ⁵⁰ , мы использовали схему маркировки разреженных изотопов ⁵¹ , что привело к упрощению спектров ¹³ C– ¹³ C до вторичные структурно-чувствительные кросс-корреляции Cα – Cβ валинов (и лейцина Cβ – Cγ).Примечательно, что согласно первичной последовательности αS и нашим наблюдениям ЯМР в растворе (рис. 1a – c) 95% остатков валина (т.е. 18 из 19) должны быть связаны с мембраной при используемом содержании заряда (100%) и Отношение αS к ND (1: 2). Хотя в отсутствие ND спектр DNP ¹³ C– ¹³ C показывает непрерывное распределение кросс-пиков валина Cα – Cβ, отражающих химические сдвиги углерода разрешенного пространства Рамачандрана (ожидаемого для изначально неупорядоченного белка, такого как αS, см. рис.2, черный), очень сильный сдвиг пика в определенный диапазон химического сдвига, типичный для α-спиральной структуры, виден после добавления НА (рис. 2, фиолетовый). Таким образом, данные DNP показывают, что αS связывает НА в α-спиральной конформации, подтверждая предыдущие исследования с использованием спектроскопии кругового дихроизма (КД) везикул, спектроскопии ЯМР раствора мицелл детергентов и твердотельной ЯМР-спектроскопии SUV ^20,23,29 . Интересно, что в отличие от SUV липидный бислой системы NDs действительно имеет определенный край, который может действовать как физический барьер для взаимодействий с αS мембраной.Геометрические соображения предполагают, что полностью протяженная α-спираль с примерно 60 остатками будет полностью покрывать диаметр одного ND. Следовательно, либо образование значительно изогнутой спирали (параллельно белкам мембранного каркаса), либо по крайней мере один изгиб спирали является обязательным для наиболее крупных наблюдаемых режимов связывания ND. Наличие довольно определенных ступеней в профилях ослабления ЯМР для 50% и 75% содержания POPG (рис. 1b, c) соответствует последнему и может указывать на возможные положения перегиба (как показано на рис.1г). Высокое сходство с ранее описанными режимами связывания SUV предполагает, что αS, подобно так называемой модели «подковы» ²² , имеет внутреннюю склонность к образованию необходимого изгиба на границе связывания с мембраной.

Связывание нанодисков индуцирует α-спиральную структуру в αS. [ ¹³ C- ¹³ C] -Протонно-управляемая спиновая диффузия, вращающаяся под магическим углом, спиннинг-ДНП, свободного неацетилированного αS в замороженном растворе (черный) и при связывании с НА со 100% липидами POPG (фиолетовый).Селективное мечение изотопов использовали для специфического мониторинга распределения химического сдвига валина Cα-Cβ. Обозначены положения пиков, указывающие на β-листовую и α-спиральную вторичную структуру. На вставке показаны нормализованные одномерные проекции выделенной области (пунктирный квадрат) в отсутствие (черный) и в присутствии 100% POPG ND. Сигнальная деконволюция этих спектров показывает, что около 92% валинов находятся в α-спиральной конфигурации в присутствии 100% POPG ND. Наличие остатков валина в последовательности αS показано вверху (синие линии).Согласно профилю ослабления ЯМР в соответствующем растворе (рис. 1c, пурпурный) 18 из 19 валинов (т.е. 94,7%) ожидаются в мембраносвязанном состоянии в используемых условиях

αS-мембранно-модулированная агрегация из-за липидной фазы

Для дальнейшего исследования влияния различных липидных свойств мы записали ЯМР-спектры αS в присутствии НА, содержащих различные липиды и липидные смеси. Данные, записанные со 100% -ным 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолином (POPC, одна ненасыщенность, нейтральный заряд), не показывают взаимодействия (рис.3а, серый), сравнимые со 100% ДМФХ (без ненасыщенности, нейтральный заряд) НА (рис. 1а – в, черный). Мы также использовали все комбинации бинарных липидных смесей DMPC, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1′-rac-глицерин) (DMPG), POPC и POPG с общим чистым зарядом 50%. Наши данные показывают, что гетерогенные смеси DMPG / POPC и POPG / DMPC, а также гомогенные смеси POPG / POPC ведут себя очень похоже (рис. 3a), что позволяет предположить, что положение заряда относительно жирной кислоты, а также шероховатость поверхности, ‘поскольку потенциально вносятся гетерогенными длинами цепей, мало влияет на взаимодействие αS с мембраной.

αS – липидному взаимодействию способствует повышенная пластичность мембраны. Профили ослабления ЯМР [ ¹⁵ N] -αS (50 мкМ) в присутствии 25 мкМ НА с указанным липидным составом (молярное соотношение 2: 1, αS-к-НА) для бислоев, которые находятся в более текучей среде a или гелевая фаза b при 10 ° C. Примечательно, что все данные ЯМР записаны при 10 ° C и pH 7,4, за исключением одного из образцов 100% DMPG (b , красные столбцы), который был записан при 37 ° C и pH 5.3. c Соответствующие анализы агрегации ThT (50 мкМ αS, 25 мкМ ND) для выбранных условий (для лучшей видимости показаны только средние значения трех измерений, цвета соответствуют соответствующим профилям ослабления в a , b )

Интересно, что смесь полностью насыщенных липидов (димиристоиллипидов) с 50% -ным содержанием заряда не сильно взаимодействует с αS (рис. 3b, бежевый). При температуре экспериментов ЯМР (10 ° C) бислой, образованный насыщенными димиристоиллипидами, в отличие от частично ненасыщенных PO-липидов, находится в гелевой фазе ( T _m около 28 ° C, дополнительный рис. .1г). При увеличении содержания заряда до 100%, но оставаясь в гелевой фазе (100% DMPG, рис. 3b, коричневый), αS демонстрирует четкое взаимодействие с мембраной, напоминающее режим связывания, который наблюдается при 50% -ном содержании заряда в жидкости. фаза. Эти данные хорошо согласуются с предыдущими данными CD о SUV, которые идентифицировали важную роль липидной фазы для αS-липидного взаимодействия ³⁰ . Хотя увеличение температуры для измерений ЯМР выше T _m приводит к ранее наблюдаемой потере сигналов ЯМР из-за процессов обмена амид-вода для большинства соответствующих остатков, снижая pH с 7.4-5.3 могут противодействовать этому эффекту (дополнительный рисунок 3c-f). Соответствующие данные ЯМР показывают, что αS образует гораздо более крупную поверхность связывания с липидами DMPG в жидкой фазе (рис. 3b, красно-коричневые столбцы, нанесены только пики с легко переносимыми резонансными соотношениями), в соответствии с предыдущими результатами с использованием везикул ^{30 , 44} , предоставляя специфичные для остатков информацию о модуляции режимов связывания αS с мембраной за счет свойств липидной фазы.

Взятые вместе, эти данные по ассоциации αS-липидов можно резюмировать следующим образом: (i) ненасыщенности в углеводородных цепях, приводящие к повышенной текучести мембран, недостаточно для индукции связывания; (ii) наличие гетерогенности в цепях жирных кислот и сочетание заряда и ненасыщенности в одной и той же молекуле липида не являются критическими; и (iii) помимо заряда для связывания важно состояние липидной фазы, которое приводит к повышенной текучести мембраны.

Мы также выполнили анализы агрегации ThT с НА, содержащими выбранные липидные смеси, как исследовали с помощью ЯМР. Все смеси, содержащие 50% отрицательно заряженных липидов, независимо от гетерогенности ацильной цепи или положения заряда, демонстрируют стабильно неизменное поведение агрегации (рис. 3c). Однако агрегация αS резко затрудняется в присутствии 100% ND DMPG (рис. 3c, красно-коричневый цвет). Поскольку анализы агрегации измеряли при 37 ° C, наши данные ЯМР (фиг. 3b, красно-коричневый) показывают, что αS находится в режиме связывания липидов, который включает область NAC и, следовательно, ожидается, что он ингибирует агрегацию.

αS и пластичность мембраны: улица с двусторонним движением

Очевидно, что исходные N-концевые остатки αS содержат центральный липид-связывающий мотив с ключевыми характеристиками, очень подходящими для взаимодействия с заряженной липидной поверхностью ^45,52 , и что эти остатки образуют спиральную вторичную структуру после связывания ^16,23,29 . На основании экспонированного и симметричного распределения остатков лизина наличие гидрофобных остатков на одной стороне спирали и распределение отрицательных зарядов на противоположной стороне (рис.4a), есть соблазн предположить, что αS принимает конформацию, взаимодействующую с липидами, как показано на рис. 4b. На этом изображении вполне вероятно, что липиды и боковые цепи лизина (частично) перестраиваются из своей «несвязанной» конформации, чтобы идеально приспособиться к электростатическим взаимодействиям. В соответствии с нашими результатами ЯМР, этой перегруппировке может способствовать более жидкая липидная фаза.

αS – липидное взаимодействие потенциально модулирует пластичность мембраны. a Молекулярные особенности ключевого способа связывания липидов αS (остатки 1–38), включая периодически и симметрично появляющиеся остатки лизина (синий цвет), которые образуют положительно заряженную «сетку» (см. Более подробную информацию в тексте). b Модель взаимодействия αS _1-61 -нанодиск (в масштабе), лизин (синий) и отрицательно заряженные остатки (красный) выделены. c αS-липидные контакты (<4 Å) на остаток, как это происходит во время моделирования МД. Нормализованные значения для взаимодействий с анионными липидами (верхняя диаграмма) или нейтральными липидами (нижняя диаграмма), дифференцируя между лизинами и всеми другими остатками, а также между мембранами гелевой / жидкой фазы (бежевые / желтые столбцы), соответственно. d Толщина бислоя (верхние панели) и площадь на липид (нижние панели) в конце моделирования МД в присутствии (сплошные линии, три независимых моделирования) и в отсутствие αS (пунктирная линия). Хотя моделирование в гелевой фазе не показывает значительного эффекта ( d , левые панели), четкая тенденция к более упорядоченному состоянию для мембраны жидкой фазы, вызванная присутствием αS, видна по увеличению толщины бислоя и уменьшению площади. на липид ( d , правые панели)

Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили МД-моделирование αS-мембранных взаимодействий.Наше моделирование сосредоточено на первом 61 остатке αS и их взаимодействиях с мембранами, образованными смесью 50% POPG – 50% POPC липидов в жидкой фазе или 50% DMPG – 50% DMPC в гелевой фазе. Данные МД подтверждают, что остатки лизина играют ключевую роль в мембранном взаимодействии, что, например, видно за счет образования значительно большего количества контактов с анионными липидами по сравнению с другими остатками (рис. 4c, верхняя диаграмма). Кроме того, обнаруживается, как правило, более сильное взаимодействие αS с анионными липидами в жидких мембранах (POPG) по сравнению с гель-фазовыми мембранами (DMPG) (рис.4в, желтый против бежевого). Примечательно, что эти эффекты гораздо менее выражены для контактов с нейтральными липидами (рис. 4в, нижняя диаграмма). Эти результаты хорошо коррелируют с эффектами липидного заряда и пластичности мембран, наблюдаемыми в анализах ЯМР и агрегации.

Интересно, что данные МД также сообщают об эффекте взаимодействия αS с липидной точки зрения. Согласно этим данным, хорошо упорядоченные липиды DMPC / PG (гелевая фаза) испытывают очень небольшие эффекты из-за присутствия αS.Эти результаты МД согласуются только с небольшими эффектами, наблюдаемыми в профилях дифференциальной сканирующей калориметрии, которые мы записали на гель-фазных НА в присутствии и в отсутствие αS (см. Дополнительный рис. 1e). С другой стороны, для МД-моделирования менее упорядоченных липидов POPC / PG (жидкая фаза) присутствие αS вызывает значительно более упорядоченное состояние липидов, о чем свидетельствует увеличенная толщина бислоя, уменьшение площади поверхности на липид и увеличение параметров порядка для углеводородные цепи (рис. 4d и дополнительный рис.4). В целом, данные МД предполагают, что взаимодействию αS с мембраной (изначально) способствует повышенная пластичность мембраны, например, через большее количество контактов, обнаруженных в жидкой фазе. Эти взаимодействия могут, следовательно, ограничивать липиды и приводить к снижению пластичности мембран. Последнее согласуется с недавними экспериментальными данными, показывающими, что связывание αS может увеличивать упаковку липидов ^53,54 , эффект, который также предположительно играет роль в функции αS как шаперона для слияния везикул, опосредованного SNARE ⁵⁵ .

Роль аффинностей и кинетики

Помимо модуляции режимов связывания за счет заряда липидов и пластичности мембран, нас также интересовали аффинности и кинетика связывания αS с мембраной. Поэтому мы измерили кинетику и термодинамику взаимодействия с помощью интерферометрии биослоя (BLI) с иммобилизованными НА с разным зарядом. В соответствии с данными ЯМР, связывание αS не было обнаружено при иммобилизации НА, содержащих 100% DMPC. Когда НА со 100% содержанием анионных липидов были иммобилизованы, наблюдалась четкая реакция при добавлении различных концентраций αS (рис.5а), что позволяет количественно описать мембранную ассоциацию с общими константами диссоциации K _D 67 ± 17 нМ (один αS на один ND) и медленной скоростью 0,015 ± 0,006 с ⁻¹ .

Взаимодействие между кинетикой взаимодействия, разным сродством к остаткам, плотностью заряда мембраны и доступной площадью поверхности модулирует агрегацию αS. Сенсограммы и BLI, полученные с иммобилизованными НА 100% POPG и добавлением различных концентраций αS.Соответствующий график отклика в установившемся режиме показан на вставке. Можно было извлечь подобранную глобальную аффинность ( K _D ) 67 ± 17 нМ и подобранную скорость отклонения 0,015 ± 0,006 с ^-1 . b Профили ослабления ЯМР при титровании 50 мкМ αS с различными концентрациями 100% POPG ND (молярные отношения αS к ND в диапазоне от 16: 1 до 1: 1, см. Цветовой код). c Соответствующие специфичные для остатков аффинности, извлеченные из данных ЯМР-титрования. Значения сообщают о пределе медленного обмена (нижнем) для аффинностей (подробности см. В тексте). d Нормализованные кривые агрегации флуоресценции ThT для выбранных соотношений αS к ND (условия такие же, как в b — g ). e ЯМР-производные способы связывания и их связь с указанным поведением агрегации (см. Дополнительное примечание 3 для получения более подробной информации о том, как были созданы модели связывания). Хотя большие количества НА с высокой плотностью заряда ингибируют агрегацию (режим связывания II), ограниченное количество высоко заряженных поверхностей мембран усиливает агрегацию (режим связывания I).Для НА с умеренной плотностью заряженных липидов наблюдали только один режим связывания αS, который мало влияет на агрегацию (режим связывания III). f Анализ нуклеации ThT в условиях покоя при pH 5,3. Хотя в этих условиях агрегация не наблюдается в отсутствие НА (дубликаты в сером цвете), присутствие 100% НД POPG в молярном соотношении 16: 1 (дубликаты в светлом и темно-синем) индуцирует первичное зародышеобразование. г — i То же, что и данные, представленные в b — d , но с использованием ND с 50% содержанием POPG

Чтобы получить специфическое для остатков представление о сродстве αS к мембране, мы дополнительно провели эксперименты по титрованию ЯМР. с использованием 100% отрицательно заряженных НА (рис.5б). В общем, аффинности ( K _D ) могут быть извлечены из профилей ослабления при ЯМР-титровании путем подгонки концентрационной зависимости ослабления с одним экспоненциальным затуханием для каждого разрешенного пика (соответствующего одному назначенному остатку в модели связывания с двумя состояниями). , т. е. несвязанный и прикрепленный к мембране). Этот метод действителен в предположении чисто медленного режима обмена. Хотя данные BLI ясно указывают на присутствие процессов медленного обмена, вклад промежуточного обмена все же следует ожидать от остатков, демонстрирующих более слабые мембранные взаимодействия, т.е.е. остатки, расположенные в центральной области αS. Для этих остатков применяемый метод не дает точных количественных значений; тем не менее качественный тренд все же можно выделить. Примечательно, что недооценка валютных вкладов приведет к более низким значениям K _D и, следовательно, полученные значения можно рассматривать как нижний предел. Результирующие аффинности, обусловленные медленным обменом ( K, _{D, slow-ex} ), показаны на фиг. 5c и показывают дифференциальное сродство к мембране для различных участков первичной последовательности αS.Как обсуждалось выше из-за смещения медленного обмена, дифференциальное сродство αS, вероятно, даже больше. Примечательно, что области с дифференциальным сродством к высокозаряженным мембранам в значительной степени перекрываются с различными режимами связывания, индуцированными разной плотностью заряда, идентифицированной ранее (рис. 1b).

Из-за геометрии используемых НА, до пяти молекул αS могут одновременно связываться α-спиралью длиной 38 остатков (первый способ связывания) с одной стороной одного НА. Если 8 молекул разместить вместе на поверхности, (в среднем) может образоваться длинная спираль из 23 остатков на мономер.Таким образом, наблюдаемое дифференциальное сродство является прямым следствием конкуренции различных мономеров за доступную площадь поверхности мембраны. В результате мембранная ассоциация более слабой взаимодействующей области NAC сильно зависит от доступности отрицательно заряженной поверхности мембраны. Важно отметить, что один НА со 100% отрицательно заряженными липидами может одновременно взаимодействовать примерно с 16 молекулами αS (по 8 на каждую сторону НА) в ходе шкалы времени ЯМР, как видно из полного исчезновения сигналов самого N- концевые остатки (рис.5б, голубой). Это означает, что в этих условиях поверхность мембраны переносит несколько молекул αS с почти полностью открытыми областями NAC в непосредственной пространственной близости.

Чтобы охарактеризовать влияние доступной площади поверхности мембраны на поведение агрегации αS, мы измерили кинетику агрегации ThT на образцах с различным соотношением αS к НА, уменьшая концентрацию НА при постоянных концентрациях αS (рис. 5d). Интересно, что более высокое отношение αS к ND приводит к заметному уменьшению времени задержки агрегации при использовании 100% POPG ND (рис.5d, синий и голубой). Эти данные показывают, в соответствии с ранее описанным поведением внедорожников ^28,29 , что при определенных условиях липидные бислои могут ускорять процесс фибрилляции. Наши данные ЯМР позволяют связать эти условия, т. Е. Ограниченную площадь поверхности мембраны с высокой плотностью заряда, с режимом связывания αS-липидов, который приводит несколько молекул αS с экспонированными участками NAC в непосредственной близости (режим связывания I на рис. 5e) .

Чтобы разобраться в влиянии НА на зародышеобразование или стадию элонгации в пути агрегации αS, мы использовали анализы ThT, преимущественно сообщающие о том или другом (см. Методы для получения более подробной информации о дизайне анализа).Чувствительные к нуклеации анализы в присутствии 100% POPG ND и соотношении αS-ND 16: 1 действительно показывают, что лежащая в основе мембранная ассоциация (способ связывания I на фиг. 5e) усиливает первичную нуклеацию (фиг. 5f, синий) . Интересно, что поскольку наши данные также позволяют оценить общее количество мономеров αS, которые оказываются в непосредственной близости из-за их взаимодействия с одним и тем же НА (т. Е. До 8 мономеров на сторону бислоя, рис. 5b синий), этот результат может также дают первое приближение количества мономеров αS, необходимых для образования ядра.Как обсуждалось выше, наши данные показывают, что это «минимальное критическое число зародышеобразования» имеет верхний предел около 8 молекул αS. Примечательно, что это число является лишь начальной оценкой и может зависеть от динамических процессов, а также локальных флуктуаций, которые могут понижать или увеличивать значение на несколько мономеров.

Анализы агрегации, чувствительные к удлинению фибрилл, проведенные в присутствии 100% POPG ND (дополнительный рис. 5c, d), не показывают влияния на скорость элонгации при соотношении αS к ND, равном 16: 1 (режим связывания I на рис.5д). Однако видно явное снижение скорости удлинения с уменьшением отношения αS к ND, что в значительной степени соответствует секвестированию мономеров, в частности доступной области NAC, вне раствора (дополнительный рис. 5c, d). Не наблюдается удлинения фибрилл для αS с полностью мембраносвязанной областью NAC (способ связывания II на фиг. 5e), что соответствует общим свойствам ингибирования агрегации этого состояния. Примечательно, что в отличие от SUV ²⁹ , изображения с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) фибрилл αS, образовавшихся в отсутствие или в присутствии НА, не показывают различной морфологии (дополнительный рис.6). Это, однако, не исключает, что (ограниченное количество) липидов также включается в фибриллы (см. Дополнительный рис. 6 и соображения стабильности для более подробного обсуждения).

Мы дополнительно провели такие же измерения BLI, ЯМР-титрование и анализ ThT для ND, содержащего только 50% липидов POPG.

Для этих ND не удалось получить четкую сигнатуру связывания в измерениях BLI, что свидетельствует о слабом сродстве и / или слишком высоких скоростях отклонения, чтобы позволить обнаружение с помощью BLI.Это соответствует профилям эксклюзионной хроматографии (SEC), которые также указывают на более временное взаимодействие (дополнительный рис. 1b, c). Однако титрование ЯМР

демонстрирует четкие профили ослабления, зависящие от концентрации, которые позволяют рассчитать (смещенное на медленный обмен) аффинность, специфичную для остатков (рис. 5g, h). Примечательно, что профили ослабления ЯМР и сродство к остаткам αS в первой связывающей области (остатки 1–38) сопоставимы со значениями, полученными для 100% заряженных НА (рис.5б, в). Напротив, для следующих областей связывания обнаруживаются гораздо более низкие аффинности (на границе обнаружения для остатков 39–60 и отсутствие взаимодействия для остатков> 60), включая отсутствие взаимодействий в области NAC. Примечательно, что для ND с 50% анионных липидов соотношение белка к ND не влияет на общий режим связывания (режим связывания III на фиг. 5e). В соответствии с экспонированной областью NAC, данные ThT для этих ND при низких соотношениях αS-ND неизменно показывают отсутствие влияния на полупериод агрегации (рис.5i). Данные при более высоких соотношениях менее воспроизводимы и демонстрируют небольшую тенденцию к увеличению продолжительности удлинения. В отличие от 100% POPG ND и в соответствии с ранее обсуждавшимися умеренными эффектами 50% POPG ND на общий процесс агрегации, мы не наблюдали ускоренного зародышеобразования αS в присутствии ND с 50% POPG, а также явного нарушения удлинения фибрилл в засеянные эксперименты (см. дополнительные данные на рис. 7 и более подробное обсуждение).

NStars2: результаты

Эта страница содержит ссылки на препринты и опубликованные статьи, полученные в результате различные проекты, реализуемые нашей группой NStars.

A. Фотометрические исследования

Аннотация: Мы представляем наблюдения 2MASSI J1835379 + 325954, ранее нераспознанного позднего типа. M карлик в пределах 6 парсек от Солнца.Выявленный на основе анализа двухмикронного обзора всего неба, оптическая спектроскопия и фотометрия указывают на спектральный класс M8,5. Звезда имеет собственное движение 0,759 \ pma и хорошо видна как на POSS I, так и на снимках. Материал фотопластинок POSS II, но, возможно, не был обнаружен ранее. обзоры из-за его близости к Галактической плоскости. Обсуждаем потенциал последствия для полноты местной переписи звезд.

Аннотация: Мы использовали новые астрометрические и спектроскопические наблюдения для уточнения полная по объему выборка M карликов, определенная в предыдущем статьи из этой серии.С добавлением астрометрии Hipparcos наша пересмотренная Выборка VC ² включает 558 звезд главной последовательности в 448 системах. Анализ этого набора данных показывает нет доказательств какой-либо систематической кинематической погрешности. Объединяя эти данные с На основе Hipparcos выборка карликов AFGK в пределах 25 парсеков от Солнца, мы получили функция светимости окрестностей Солнца Phi (M _V ) для звезд с абсолютной звездной величиной от -1 до +17. Используя эмпирические и полуэмпирические соотношения масса-M _V , мы преобразовать $ \ Phi $ (M $ _V $) к современной функции масс, psi (M) (dN \ dM).В зависимости от принята калибровка светимости-массы, фунт / кв. дюйм (М) может быть представлен двухкомпонентным или трехкомпонентный степенной закон. В любом случае степенной закон индекс альфа имеет значение ~ 1,3 при малых массах (0,1 Sun pc ^-3 .
Мы преобразовали psi (M) в оценку начальной функции масс, Psi (M), учитывая звездную эволюцию, закон плотности перпендикулярно плоскости и местная смесь звездного населения. Результаты дают альфа от 1,1 до 1,3 при малых массах и альфа = 2.От 5 до 2,8 при больших массах, с изменением наклона от 0,7 до 1,1 M _Sun . Наконец, распределения скоростей (U, W) как образца VC ² , так и более слабые (M _V > 4) звезды в 25-пк выборке Hipparcos являются хорошо представлены двухкомпонентными Гауссовы распределения, с ~ 10% звезд в более высоких составляющая дисперсии скорости. Мы предлагаем, чтобы последний компонент является толстым диском, и предлагаем возможное объяснение относительно низких дисперсий скоростей, показанных сверхкрутые карлики.

Аннотация: Мы представляем первые результаты наших усилий по созданию статистически надежной, ограниченная по объему выборка ультрахолодных карликов из второстепенных данных 2MASS Релиз. Мы занимаемся комплексным поиском ближайших карликов позднего типа. и это первая часть нашего поиска с использованием чисто фотометрических выбор.Целью данной работы является определение маломассивной звезды. и функция светимости коричневого карлика в инфракрасном диапазоне. Здесь мы очерчиваем построение образца, получившего название 2MU2, и представляем наши первые результаты, включая открытие 186 карликов M7 — L6 — 47 из них, вероятно, находятся в пределах 20 шт Солнца. Эти результаты представляют 66% кандидатов в сверхохлаждение. в нашей выборке все же составляют 127% -ное увеличение количества ультрахолодных карликов известна в искомом объеме (покрывает 40% неба до 20 пк).Кроме того, мы идентифицировали 10 объектов M4 — M6,5, которые могут находиться в пределах 20 ПК (или в пределах 1-сигмы). Наконец, исходя из этих исходных данных, представим предварительную функцию светимости и обсудим несколько интересных особенностей частичный образец представлен здесь. Как только наш образец будет готов, мы будем использовать наш измеренная функция светимости для ограничения функции масс маломассивных звезд и коричневые карлики.

Аннотация: Обследования близлежащих карликов с низкой светимостью, как правило, избегают густонаселенных регионов Галактической плоскости.Мы разработали величину цвета в ближнем инфракрасном диапазоне и Критерии выбора цвета-цвета, разработанные для идентификации карликов позднего типа M и раннего типа L в пределах 12 парсеков от Солнца. Мы используем эти критерии для поиска кандидаты в регионах Галактической плоскости (| b |

B. Звезды правильного движения: продолжение NLTT

Резюме: В настоящее время мы реализуем программу, направленную на выявление ранее нераспознанных карлики позднего типа в пределах 20 парсек от Солнца.В качестве первого шага мы сделали перекрестные ссылки на каталог собственных движений NLTT Люйтена и второй инкрементный выпуск каталога точечных источников 2MASS и использовать оптические / инфракрасные цвета, полученные путем комбинирования Luytens’s m _r оценки с данными 2MASS, чтобы идентифицировать кандидатов близких звезд. В этой статье описывается определение ссылки. образец из 1245 звезд и представляет собой сборник литературы данные для более чем одной трети выборки. Только 274 звезды имеют тригонометрическую измерения параллакса, но мы использовали данные для ближайших звезд с четко определенными тригонометрическими параллаксами для вычисления отношения цвет-величина в (M _V , (V-K)), (M _V , (V-I)) и (M _I , (I-J)) плоскости, и используйте эти соотношения для определения фотометрических параллаксов для звезд NLTT с оптическим фотометрия.Только на основании данных 2MASS JHK мы определили еще 42 ультрахолодных карлика ((J-K> 0,99) и используйте (J-K) цвета для оценки фотометрических параллаксов. Комбинируя эти различные методы, мы идентифицируем 308 звезд с формальными расстояния менее 20 парсеков, а еще 46 имеют оценки расстояния в пределах 1 сигмы от лимита нашего опроса. Из этих 354 звезд 75, в том числе 39 ультрахолодных карликов. являются новыми для ближайших звездных каталогов. Две звезды с как оптическая, так и ближняя инфракрасная фотометрия являются потенциальным дополнением к непосредственное солнечное окружение с формальными оценками расстояния менее 10 парсек.

Аннотация: Мы представляем BVRI-фотометрию 180 ярких кандидатов в южные близкие звезды. Звезды были выбраны из каталога собственных движений New Luyten Two-Tenths на основе на оптических / инфракрасных цветах, построенный путем объединения оценок Luytens m _r с фотометрия в ближнем инфракрасном диапазоне из 2-микронного обзора всего неба.Фотометрические параллаксы полученный из цветов (V-K), (V-I) и (I-J), в сочетании с ограниченным доступным астрометрии, показывают, что целых 108 звезд может находиться в пределах 20 парсек от Солнца. Из них 53 — новые для ближайшей звезды. каталоги, в том числе три в пределах 10 парсек от Солнца.

Аннотация: Мы представляем первые результаты поиска по всему небу для позднего типа. карлики в пределах 20 парсеков от Солнца, используя New Luyten Two-Tenths (NLTT) каталог имеет перекрестные ссылки с базой данных 2-микронного обзора всего неба (2MASS).Представленные здесь результаты были получены с помощью оптического спектроскопическое наблюдение за кандидатами в близкие звезды в качестве предварительной проверки нашей методология. M _J , полученный с использованием спектральных индексов, и 2MASS J используются для оценить расстояния. Из 70 наблюдаемых объектов 28 идентифицированы как ранее нераспознанные объекты в пределах 25 парсеков от Солнца и до 19 из них находятся в пределах 20 парсеков. Один, LP647-13 — это тип M9 карлик на 10,5 парсек, что делает его одним из трех ближайших карликов M9, известных в настоящее время.Мы также обсуждаем хромосферную активность наблюдаемых карлики.

Аннотация: Сравнение оптической фотометрии и фотометрии в ближнем инфракрасном диапазоне 2MASS для больших выборок каталогизированных звезд собственного движения может открыть для себя ранее нераспознанные близлежащие объекты редкого типа. В этой статье мы представляем открытие двух новых углеродных карликов, LSR 2105 + 2514 и LP 758-43, которые были взяты из списков собственных движений и лежат в малонаселенной части оптического / ближнего ИК-цветового пространства.Их оптические спектры, демонстрирующие поглощение C_2 и / или CN, обсуждаются. Считается, что LSR 2105 + 2514 находится в пределах 200 шт. И будет иметь M_ (K_s) B5. И. Н. Рид, Круз, К.Л., Аллен, П., Мунгалл, Ф., Килкенни, Д., Либерт, Дж., Хоули, С.Л., Фрейзер, О.Дж., Кови, К.Р., Лоуренс, П.Дж. 2003, Астр. J., в печати Встреча с новыми крутыми соседями VII: Спектроскопия слабых красных карликов NLTT
ссылка на astro-ph

Аннотация: Мы представляем оптическую спектроскопию низкого разрешения и BVRI-фотометрию 453 кандидатов в близкие звезды, взятые из каталога собственных движений NLTT.В звезды были выбраны на основе оптических / ближних инфракрасных цветов, полученных путем объединения фотографических данных NLTT с фотометрией из 2MASS Second Добавочный выпуск данных. На основе полученных фотометрических и спектральных параллаксов мы идентифицируем 111 звезд как лежащих в пределах 20 парсеков от Солнца, включая 9 звезд с формальной оценкой расстояния менее 10 парсеков. Еще 53 звезды имеют оценки расстояния в пределах 1 сигма от нашего предела в 20 парсек. Почти все эти звезды добавлены к списку ближайших звезд.Всего наш обзор на основе NLTT на сегодняшний день выявил 496 звезд, которые, вероятно, находятся в пределах 20 парсеков, из которых 195 являются дополнениями к каталогам ближайших звезд. Большинство недавно идентифицированных близких звезд имеют спектральный класс от M4 до M8.

C. Новые товарищи

Аннотация: Мы представляем спектроскопию низкого разрешения недавно открытых кандидаты в спутники трех звезд в Солнечном Окрестности.Все три компаньона — M карлики со спектральными классами от M4 до M9,5. В двух случаях, G85-55`B ‘(M6) и G87-9`B’ (M4), мы имеем косвенные данные спектроскопии, фотометрии и ограниченного астрометрии, что системы физические двоичные файлы; в третьем, G216-7B (M9.5), сравнение POSS II IIIaF Материал пластины и изображение 2MASS указывают на обычное собственное движение. Первичная звезда в этой системе, G216-7A (M0), сама по себе неразрешенная двойная система с почти равной массой. Все три маломассивных компаньона с большой вероятностью будут звездными по своей природе, хотя G216-7B лжет очень близко к пределу сжигания водорода.

Аннотация: Ипсилон Андромеды — звезда F8 V, имеющая внесолнечную систему размером как минимум три планеты вращаются вокруг него. Здесь мы сообщаем открытие маломассивного звездного спутника этой системы. Товарищ имеет общее собственное движение, лежит в проекции разделение 750 а.е., и имеет спектральный класс M4.5 V. влияние этой звезды на лучевую скорость более яркой главной звезды незначительно, но эта система представляет собой интересный испытательный стенд для теория образования звездных планет и понимание динамических стабильность, поскольку это первая известная множественная планетная система в составе множественной звездной системы.

D. Активность и молодые карлики позднего типа

Аннотация: Спектрофотометрия ime-серии карлика L5 2MASS J01443536-0716142 показала сильную эмиссию Hα, которая снизилась почти на 75% за четыре последовательных экспозиции.На спектре, полученном спустя 11 месяцев, в эмиссии линия не обнаружена. Это поведение контрастирует с поведением 2MASSI J1315309-264951, карлика L5, который показал еще более сильная эмиссия Hα в четырех разных случаях. Наблюдательная база данных свидетельствует о том, что L-карлики в таких сильных вспышках могут встречаться лишь изредка, при этом рабочий цикл порядка 1%. Напротив, несколько постоянно сильных Hα-излучателей, включая PC 0025 + 0447 и 2MASSI J1237392 + 652615, должны быть либо (1) объектами не старше 10-100 млн лет с постоянно активной аккрецией и / или хромосферами, но которые, по-видимому, образовались изолированно от известных молодых звездных скоплений и ассоциации или (2) объекты, наделенные другим, но неизвестным механизмом для энергии Ha.

Вмешательство в VE-PTP стабилизирует эндотелиальные соединения in vivo через Tie-2 в отсутствие VE-кадгерина | Журнал экспериментальной медицины

Сосудистый эндотелиальный (VE) -белковый тирозинфосфатаза (PTP) связывается с VE-кадгерином, тем самым поддерживая его адгезивную активность и целостность эндотелиального соединения. VE-PTP также связывается с Tie-2, подавляя тирозинкиназную активность этого рецептора, который может поддерживать стабилизацию эндотелиальных соединений.Здесь мы проанализировали, как вмешательство с VE-PTP влияет на стабильность эндотелиальных соединений in vivo. Блокирование VE-PTP антителами, специфическим фармакологическим ингибитором (AKB-9778) и удаление гена противодействовали индукции сосудистой утечки медиаторами воспаления. Кроме того, уменьшалась трансмиграция лейкоцитов через эндотелиальный барьер. Вмешательство в экспрессию Tie-2 in vivo обращало стабилизирующие переходы эффекты AKB-9778 в эффекты, дестабилизирующие переходы. Кроме того, недостатка Tie-2 было достаточно, чтобы ослабить сосудистый барьер.Механически ингибирование VE-PTP стабилизировало эндотелиальные соединения через Tie-2, что запускало активацию Rap1, которая затем вызывала растворение радиальных стрессовых волокон через Rac1 и подавление немышечного миозина II. Примечательно, что устранение гена VE-кадгерина не устраняет стабилизирующее соединение действие ингибитора VE-PTP. В совокупности мы пришли к выводу, что ингибирование VE-PTP стабилизирует зараженные эндотелиальные соединения in vivo посредством Tie-2 с помощью независимого от VE-кадгерина механизма. В отсутствие Tie-2, однако, ингибирование VE-PTP дестабилизирует целостность эндотелиального барьера в соответствии с поддерживающим VE-кадгерином эффектом VE-PTP.

Эндотелий стенки кровеносного сосуда образует барьер для растворенных в крови веществ и лейкоцитов. Поступление молекул и клеток иммунной системы в воспаленную ткань в основном регулируется через эндотелиальные соединения. Сосудистый эндотелиальный (VE) -cadherin является центральным компонентом этих соединений и обычно считается одним из основных адгезивных механизмов, которые контролируют стабильность и барьерную функцию эндотелия (Dejana and Vestweber, 2013).Антитела против VE-кадгерина могут дестабилизировать эндотелиальные соединения in vitro и in vivo (Breviario et al., 1995; Gotsch et al., 1997; Corada et al., 1999). В соответствии с этим, усиление адгезивной функции VE-кадгерина путем прямого слияния его с α-катенином блокирует индукцию сосудистой проницаемости в коже соответствующих мышей с нокаутом и сильно снижает экстравазацию лейкоцитов в различных тканях (Schulte et al. , 2011).

Было показано, что VE-протеинтирозинфосфатаза (PTP) связывается с VE-кадгерином и тем самым усиливает адгезионную функцию VE-кадгерина (Nawroth et al., 2002; Nottebaum et al., 2008). Медиаторы, индуцирующие проницаемость, такие как фактор роста VE (VEGF) и прикрепление лейкоцитов к эндотелиальным клеткам (ECs), оба стимулируют сигнальный путь, который запускает диссоциацию VE-PTP от VE-кадгерина (Nottebaum et al., 2008; Vockel and Вествебер, 2013). Эта диссоциация необходима для индукции проницаемости сосудов и экстравазации лейкоцитов in vivo. Доказательства этого были основаны на анализе мышей, у которых модифицированные формы VE-кадгерина и VE-PTP, каждая из которых содержит разные сайты связывания для соединения с малой молекулярной массой, были выбиты в локус VE-кадгерина (Broermann и другие., 2011). У этих мышей введение соответствующего соединения ингибировало диссоциацию VE-PTP от VE-кадгерина и тем самым ослабляло индукцию сосудистой проницаемости и экстравазацию лейкоцитов, демонстрируя важность VE-кадгерин-ассоциированного VE-PTP для контроля эндотелиального соединения. стабильность in vivo. Более того, недавно сообщалось, что HIF2α усиливает целостность эндотелиального барьера, частично за счет индуцированной экспрессии VE-PTP (Gong et al., 2015). В соответствии с этими данными было показано, что фосфорилирование VE-кадгерина тирозином участвует в регуляции контактов с ЭК in vitro (Allingham et al., 2007; Turowski et al., 2008; Monaghan-Benson and Burridge, 2009) и in vivo (Orsenigo et al., 2012; Wessel et al., 2014).

VE-PTP также связывается с Tie-2 (Fachinger et al., 1999), рецептором эндотелиальной тирозинкиназы, который регулирует ангиогенез и может поддерживать целостность эндотелиальных соединений. Удаление гена VE-PTP вызывает эмбриональную летальность в эмбриональный день (E) 9.5 (Bäumer et al., 2006; Dominguez et al., 2007). Это вызвано дефектом ремоделирования кровеносных сосудов, приводящим к увеличению и сращиванию сосудистых структур.Антитела против VE-PTP вызывают сходные дефекты при инкубации с культурами эксплантатов аллантоиса мышей WT, но не, если ткань происходит от мышей с дефицитом гена Tie-2 (Winderlich et al., 2009). Кроме того, эти антитела против внеклеточной части VE-PTP диссоциируют фосфатазу от Tie-2 и вызывают фосфорилирование этого рецептора и передачу сигналов (Winderlich et al., 2009).

Недавно мы показали, что специфический фармакологический ингибитор каталитической активности VE-PTP, AKB-9778, активировал Tie-2 у мышей, и это коррелировало с подавлением глазной неоваскуляризации и блокированием VEGF-индуцированной утечки сосудов (Shen et al., 2014). Хотя прямые доказательства актуальности Tie-2 все еще отсутствуют, эти результаты согласуются с исследованиями, в которых сообщается, что лиганд Tie-2 Ангиопоэтин-1 (Ang1) защищает сосудистую сеть от утечки плазмы (Gamble et al., 2000; Thurston et al. др., 2000; Маммото и др., 2007; Гавард и др., 2008). В модели рака груди у мышей AKB-9778 нормализовал сосуды опухоли и замедлял рост опухоли (Goel et al., 2013). Также было обнаружено, что VE-PTP связан с рецептором VEGF-2 (VEGFR-2; Mellberg et al., 2009), и было предположено, что это взаимодействие влияет на активность VEGFR-2 в эндотелиальных отростках эмбриоидных тел мышей (Hayashi et al., 2013).

Здесь мы проанализировали, как вмешательство в активность VE-PTP влияет на эндотелиальные соединения у взрослых мышей и как это связано с функциями Tie-2 и VE-кадгерина. Мы обнаружили, что условное удаление гена VE-PTP, а также вмешательство в действие антител или введение ингибитора AKB-9778 стабилизировали зараженные эндотелиальные соединения, тем самым предотвращая повышенную проницаемость и экстравазацию лейкоцитов, вызванную медиаторами воспаления.Эти эффекты требовали экспрессии Tie-2, потому что блокирование его экспрессии in vivo обращало эффект ингибитора VE-PTP на целостность эндотелиального соединения. Таким образом, ингибирование VE-PTP стабилизирует зараженные эндотелиальные соединения через Tie-2 и дестабилизирует их в отсутствие Tie-2. Примечательно, что эффект стабилизации соединений наблюдался даже у мышей с условным дефицитом гена VE-кадгерина. Ингибирование образования утечки сопровождалось активацией Rap1 и ремоделирования цитоскелета, а также снижением образования волокон радиального напряжения.Наши результаты показывают, что ингибирование VE-PTP in vivo оказывает противоположное влияние на эндотелиальные соединения в результате его различных эффектов на VE-кадгерин и на Tie-2. Активация Tie-2 посредством ингибирования VE-PTP защищает эндотелиальные соединения от дестабилизации, вызванной воспалением, и отменяет негативный эффект ингибирования VE-PTP на адгезивную функцию VE-кадгерина.

Недавно мы показали, что фармакологический ингибитор фосфатазы с высокой специфичностью к VE-PTP, AKB-9778, противодействует VEGF-индуцированной проницаемости через монослои HUVEC и VEGF- и гистаминовой проницаемости сосудов кожи мышей в классическом анализе Майлса ( Шен и др., 2014). Чтобы проверить, действительно ли эти эффекты были вызваны ингибированием VE-PTP и никаких других фосфатаз, здесь мы проверили, будут ли очищенные аффинно очищенные pAb против внеклеточной части VE-PTP иметь аналогичные эффекты. Монослои HUVEC, выращенные на фильтрах трансвелл, предварительно инкубировали либо с контрольными антителами из преиммунной сыворотки, либо с аффинно очищенными антителами против VE-PTP с последующей инкубацией с реагентом, индуцирующим проницаемость, или без него. Как показано на рис. 1 (A и B), существенное увеличение проницаемости для FITC-декстрана 250 кДа, индуцированное тромбином или VEGF, эффективно снижалось с помощью антител против VE-PTP.Сходные результаты были получены, когда мы заменили обработку антителами инкубацией с 10 мкМ AKB-9778 в течение 30 минут, тогда как один носитель не оказал никакого эффекта (рис. 1С). Оба этих независимых метода ингибирования VE-PTP индуцировали фосфорилирование тирозина субстрата VE-PTP Tie-2 (фиг. 1 D).

Чтобы проверить, будут ли антитела против внеклеточного домена VE-PTP также стабилизировать эндотелиальный барьер in vivo, мы провели анализ Майлза на мышах C57BL / 6.После i.v. введение 200 мкг аффинно-очищенных антител против VE-PTP или контрольных антител, синий Эванс внутривенно. инъецировали через 30 минут после введения антитела, и через 10 минут кожу обрабатывали внутрикожной инъекцией PBS или VEGF (25 нг в 50 мкл). Антитела против VE-PTP блокировали VEGF-индуцированную проницаемость сосудов на 55% (± 7%; рис. 1 E). У тех же мышей обработка антителом против VE-PTP стимулировала фосфорилирование тирозина Tie-2, как видно на иммуноблотах Tie-2, который был иммунопреципитирован из лизатов легких (рис.1 F). В совокупности эти результаты показывают, что ингибирование VE-PTP с помощью антител или низкомолекулярного ингибитора противодействует дестабилизации контактов EC in vitro и in vivo, эффект, который коррелирует с активацией Tie-2.

Чтобы проанализировать значимость VE-PTP для целостности эндотелиальных соединений in vivo независимо от фармакологических ингибиторов, мы проанализировали мышей с инактивированным геном Ptprb .Поскольку этот ген важен для эмбрионального развития (Bäumer et al., 2006; Dominguez et al., 2007), мы получили мышей с экзоном 20 гена Ptprb , фланкированным сайтами loxP (Fig. 2 A). Cre-опосредованное вырезание экзона 20, как было предсказано, вызовет усечение белка VE-PTP внутри 17-го фибронектинового типа III-подобного повтора внеклеточного домена, потому что удаление экзона 20 создает стоп-кодон в рамке считывания в начале экзона 21 Как следствие, это приведет к удалению трансмембранного и каталитического домена фосфатазы.Саузерн-блот-анализ ДНК созданных мышей с помощью внешнего зонда (не показан), а также генотипирование методом ПЦР показали ожидаемые результаты (рис. 2В). Чтобы подтвердить, что удаление Cre экзона 20 приводит к функциональному аллелю Ptprb -null, мышей скрещивали с драйверной линией Pgk-Cre , которая экспрессировала рекомбиназу Cre на стадии одноклеточного эмбриона. Гомозиготная делеция привела к эмбриональной летальности на E9.5 (не изображена), подобно тому, как показано ранее для мышей с дефицитом гена, у которых либо экзон 18 (Bäumer et al., 2006) или экзон 1 (Dominguez et al., 2007) был конститутивно удален.

Для инактивации Ptprb в постнатальных ЭК мышей Ptprb ^{lox / lox} скрещивали с индуцируемыми тамоксифеном трансгенными животными Pdgfb-iCre . Чтобы проверить влияние Cre-индуцированной делеции на экспрессию белка VE-PTP, мы провели иммуноблоттинг первичных ЭК, выделенных из легких Pdgfb-iCre ⁺ , Ptprb ^{lox / lox} ( Ptprb ^iECKO ) мутанты, которые повторно лечили i.п. уколы тамоксифена. pAb против первых восьми FN-подобных повторов внеклеточной части VE-PTP распознавали VE-PTP в иммуноблотах клеточных лизатов ЭК от мышей WT, но не обнаруживали укороченную форму VE-PTP в лизатах ЭК мышей мутантные мыши (рис. 2 C). Аналогичным образом, усеченная форма VE-PTP не была обнаружена в культуральных супернатантах этих клеток (фиг. 2 D). Таким образом, если ожидаемая усеченная форма VE-PTP была выражена, она, скорее всего, была нестабильной. В соответствии с этим, VE-PTP не был обнаружен FACS на первичных ЭК этих мышей (не изображен).

Чтобы определить, повлияет ли удаление гена VE-PTP на целостность эндотелиальных соединений, мы выполнили анализ Майлза с мышами WT и мутантами Ptprb ^iECKO . На основе i.v. после инъекции синего Эванса и внутрикожного введения VEGF или гистамина мы обнаружили, что индукция проницаемости явно снижалась у мышей Ptprb ^iECKO , обработанных тамоксифеном (фиг. 2 E). Иммуноблоты лизатов легких этих мышей, зондированных антителами против внеклеточной части VE-PTP, показали, что Cre-индуцированная абляция гена приводит к потере большей части белка VE-PTP (рис.2 F). Сильное ингибирование VEGF- и гистаминовой проницаемости сосудов также наблюдалось с ингибитором VE-PTP AKB-9778 (24 мг / кг) у мышей WT (рис. 2E), тогда как он не оказывал дополнительного ингибирующего эффекта на индукцию проницаемость сосудов у мышей Ptprb ^iECKO , что подтверждает высокую специфичность ингибитора VE-PTP (рис. 2 E). В соответствии с этими результатами, делеция VE-PTP и ингибитор VE-PTP усиливали фосфорилирование Tie-2 in vivo, как было определено в фосфотирозиновых блотах Tie-2, иммунопреципитированных из лизатов легких (рис.2 G). Опять же, ингибитор не оказывал аддитивного действия на фосфорилирование Tie-2 у мышей Ptprb ^iECKO (фиг. 2 G). Эти результаты демонстрируют, что ингибитор фосфатазы AKB-9778 стабилизирует зараженные контакты EC и селективно активирует Tie-2 in vivo через VE-PTP. В совокупности эти результаты показывают, что фармакологическое ингибирование или генетическое устранение VE-PTP противодействует дестабилизации контактов с ЭК.

Поскольку фармакологическое ингибирование и генетическое устранение VE-PTP как стабилизируют целостность эндотелиального барьера, так и увеличивают фосфорилирование Tie-2, мы спросили, требуется ли Tie-2 для стабилизирующего соединения эффекта ингибитора.Поэтому мы трансфицировали HUVEC с помощью миРНК Tie-2 или контрольной миРНК и протестировали эффект 10 мкМ AKB-9778 или одного носителя на индуцированную тромбином проницаемость монослоев этих клеток для FITC-декстрана. Как показано на фиг. 3А, AKB-9778 блокировал индуцированную тромбином проницаемость в условиях контроля миРНК, тогда как этот эффект больше не наблюдался, если экспрессия Tie-2 ингибировалась миРНК. Экспрессия Tie-2 ингибировалась обработкой миРНК на 86%, и никакого эффекта не наблюдалось для VE-PTP или VE-кадгерина (рис.3 С). Таким образом, стабилизирующий эффект AKB-9778 на эндотелиальные соединения зависит от Tie-2.

Когда аналогичные эксперименты были выполнены без обработки тромбином, мы обнаружили, что исходная проницаемость монослоев HUVEC не зависела от AKB-9778, если Tie-2 все еще экспрессировался (контрольная миРНК), тогда как ингибитор увеличивал проницаемость, если экспрессия Tie-2 была снижена ( Рис. 3 B). Тот факт, что AKB-9778 не влиял на исходную проницаемость, когда Tie-2 все еще экспрессировался, побудил нас проверить влияние AKB-9778 и олигомерного матричного протеина (Comp) -Ang1 хряща на исходную проницаемость конфлюэнтных HUVEC при различной плотности.Мы обнаружили явные ингибирующие эффекты AKB-9778 на конфлюэнтных монослоях клеток, засеянных при более низкой плотности клеток в 2,7 раза, тогда как эффект пропадал при более высокой плотности клеток (4,5 × 10 ⁴ клеток / см ² против 1,2 × 10 ⁵ клеток / см ² , выращенных в течение 54 ч; фиг. 3 D). Поскольку экспрессия соединения VE-PTP и ассоциация с VE-кадгерином слабы при низкой плотности клеток и увеличиваются при более высоком слиянии (Nottebaum et al., 2008), мы предполагаем, что только при высоком слиянии действие AKB-9778 на VE-кадгерин компенсирует влияние на Tie-2, тогда как при более низком слиянии влияние через Tie-2 является доминирующим.В соответствии с этим Comp-Ang1 ингибировал проницаемость на обоих уровнях слияния (фиг. 3 D).

В соответствии с ранее опубликованными экспериментами по подавлению Tie-2 (Hakanpaa et al., 2015), только ингибирование экспрессии Tie-2 привело к повышенной проницаемости эндотелия (рис. 3 B), что позволяет предположить, что Tie-2 необходим для целостности контакта с клетками. . Механически Tie-2 может поддерживать целостность соединения, противодействуя передаче сигналов Ang-2-интегрин, что дестабилизирует контакты между клетками (Hakanpaa et al., 2015). Кроме того, внутренняя киназная активность Tie-2 может нести ответственность за усиление целостности контакта с клетками.

Дестабилизирующее соединение действие AKB-9778 в отсутствие Tie-2 согласуется с поддерживающим эффектом VE-PTP в отношении VE-кадгерина (Nottebaum et al., 2008; Broermann et al., 2011). Потенциальными субстратами VE-PTP, которые ответственны за этот эффект, являются VE-кадгерин-Y685 и плакоглобин (Nottebaum et al., 2008; Wessel et al., 2014), и оба фосфорилируются после обработки ЭК AKB-9778 (не изображены). Другими кандидатами могут быть VEGFR-2 (Hayashi et al., 2013) или Src, которые имеют отношение к фосфорилированию VE-кадгерина. Чтобы проверить это, мы либо трансфицировали HUVEC контрольной миРНК, либо миРНК Tie-2 и обрабатывали клетки либо одним носителем, либо 5 мкМ AKB-9778 в течение 30 минут с последующей иммунопреципитацией VEGFR-2 или Src и иммуноблоттингом на фосфо-фосфат. тирозин или для Src-pY418.Как показано на фиг. 3 (E и G), AKB-9778 индуцировал фосфорилирование тирозина VEGFR-2 независимо от экспрессии Tie-2, но не оказывал значительного влияния на фосфорилирование Src. VEGF индуцировал фосфорилирование VEGFR-2 немного более эффективно, чем AKB-9778 (фиг. 3 F).

Чтобы проверить, отвечает ли Tie-2 также за стабилизирующее соединение действие AKB-9778 in vivo, мы ингибировали экспрессию Tie-2 у мышей с помощью миРНК in vivo с использованием реагента для трансфекции на основе полиэтиленимина (in vivo-jetPEI). .Как показано на рис. 3 J, i.v. инъекция миРНК Tie-2 могла эффективно блокировать экспрессию Tie-2, как было проанализировано с помощью иммуноблоттинга лизатов легких. Количественная оценка сигналов иммуноблоттинга для 13 контрольных и 12 мышей, обработанных миРНК Tie-2, показала снижение экспрессии Tie-2 на 74% (± 4%) (рис. 4 G). Мышей, получавших реагент для трансфекции в комбинации либо с контрольной миРНК, либо с миРНК Tie-2, анализировали на базальную (фиг. 3 H) и LPS-индуцированную проницаемость сосудов в легких (фиг. 3 I).Для заражения ЛПС мышей подвергали воздействию ЛПС в виде аэрозоля в течение 40 минут, и проницаемость сосудов определяли путем инъекции синего Эванса через 4 часа в течение 15 минут. Как показано на фиг. 3H, AKB-9778 не оказывал эффекта на исходную проницаемость сосудов, когда экспрессировался Tie-2 (состояние ctrl siRNA). Напротив, обработка миРНК Tie-2 незначительно увеличивала проницаемость сосудов (на 27 ± 10%), а введение AKB-9778 дополнительно увеличивало проницаемость еще на 43% (± 13%; фиг. 3 H). Индуцированная LPS проницаемость у мышей, экспрессирующих нормальные уровни Tie-2 (ctrl siRNA), может быть явно противодействовать ингибитору AKB-9778, тогда как LPS-индуцированная проницаемость у мышей, обработанных Tie-2 siRNA, больше не могла подавляться этим соединением ( Инжир.3 I). Таким образом, по аналогии с результатами in vitro, экспрессия Tie-2 требовалась для защитного действия AKB-9778 на вызванную воспалением проницаемость сосудов в легких. Кроме того, в исходных условиях ингибирование экспрессии Tie-2 превращает стабилизирующий переходный эффект ингибитора VE-PTP в дестабилизирующий переходный эффект (фиг. 3, B и H). Наконец, экспрессия Tie-2 важна для базовой целостности стенки кровеносных сосудов.

Стабилизирующий эффект ингибитора VE-PTP AKB-9778 на соединения EC побудил нас проверить, будет ли этот ингибитор также влиять на трансмиграцию лейкоцитов.Монослои HUVEC культивировали на фильтрах через лунки, предварительно обрабатывали за 48 ч до теста либо контрольной миРНК, либо миРНК Tie-2, а затем через 33 часа инкубировали с 5 нМ TNF и 5 мкМ AKB-9778 или только носителем. Ингибитор фосфатазы уменьшал трансмиграцию нейтрофилов на 40% (± 3,9%), если клетки были предварительно обработаны контрольной миРНК (рис. 4 A). По аналогии с анализами проницаемости на фиг. 3, ингибирование экспрессии Tie-2 с помощью siRNA увеличивает трансмиграцию нейтрофилов (фиг. 4 A), в соответствии с предыдущим исследованием, показывающим, что подавление Tie-2 усиливает трансэндотелиальную миграцию раковых клеток (Hakanpaa et al. al., 2015). Этот эффект был дополнительно усилен, если ингибитор VE-PTP был добавлен к клеткам, предварительно обработанным Tie-2 siRNA (рис. 4 A). Экспрессия Tie-2 была снижена на 90% (фиг. 4 B). Ни AKB-9778, ни обработка миРНК Tie-2 не влияли на уровни экспрессии ICAM-1 (фиг. 4С). AKB-9778 также ингибировал трансмиграцию человеческих Т-клеток через HUVEC к производному от стромальных клеток фактору 1α (SDF-1α; фиг. 4 D). Таким образом, ингибирование активности VE-PTP подавляет диапедез нейтрофилов и лимфоцитов, и этот эффект требует присутствия Tie-2.Однако при подавлении экспрессии Tie-2 действие ингибитора VE-PTP меняется на противоположное. Опять же, этот дестабилизирующий переходный эффект AKB-9778 при низких уровнях экспрессии Tie-2 согласуется с поддерживающей ролью VE-PTP для адгезивной функции VE-кадгерина.

Затем мы проверили влияние ингибитора VE-PTP на рекрутирование нейтрофилов в легкие мышей, зараженных LPS. AKB-9778 вводили однократно подкожно в дозе 24 мг / кг мышам, которым 48 ч до этого вводили ctrl siRNA.Мыши вдыхали аэрозольный ЛПС в течение 40 минут, а через 4 часа нейтрофилы, попавшие в легкие, выделяли с помощью бронхоальвеолярного лаважа. Мы обнаружили, что AKB-9778 ингибировал экстравазацию нейтрофилов на 60% (рис. 4 E). Этот ингибирующий эффект AKB-9778 сильно снижался, когда экспрессия Tie-2 подавлялась обработкой миРНК Tie-2 (фиг. 4 E). Экспрессия Tie-2 снижалась на 70–80% под действием siRNA, как было проанализировано с помощью иммуноблоттинга лизатов легких (рис. 4, F и G). Таким образом, ингибирование VE-PTP ослабляет диапедез лейкоцитов in vitro и in vivo через Tie-2.

Противоположные эффекты ингибирования VE-PTP на функцию VE-cadherin, с одной стороны, и на стабилизацию соединения посредством Tie-2, с другой стороны, подняли вопрос, с помощью какого механизма AKB-9778 усиливает стабильность соединения. Было высказано предположение, что активация Tie-2 стабилизирует соединения посредством стимуляции Rac1, что вызывает дезактивацию RhoA (Mammoto et al., 2007). В соответствии с этим мы обнаружили, что и 10 мкМ AKB-9778, и 200 нг / мл Comp-Ang1 активируют GTPase Rac1 в HUVEC (рис.5 А).

Затем мы проверили, может ли AKB-9778 обратить вспять активирующее действие тромбина на фосфорилирование немышечной легкой цепи миозина (MLC). Как показано на фиг. 5В, инкубация HUVEC в течение 2 минут с 1 ед. / Мл тромбина усиливала фосфорилирование MLC по Thr18 и Ser19, как было обнаружено в иммуноблотах. Этот эффект был явно уменьшен AKB-9778 (рис. 5B).

В соответствии с этими эффектами, мы обнаружили, что усиленное тромбином образование радиальных стрессовых волокон в монослоях HUVEC было уменьшено AKB-9778, как было показано окрашиванием F-актином (рис.5 С). Линеаризация соединений с помощью AKB-9778, как визуализировано при окрашивании на VE-кадгерин, указывает на снижение механического напряжения на клеточных контактах (фиг. 5 C).

Чтобы идентифицировать этапы передачи сигналов, которые будут запускаться ингибированием VE-PTP перед активацией Rac1, мы протестировали активацию Rap1, GTPase, которая, как известно, стабилизирует соединения EC. Мы обнаружили, что инкубация HUVEC в течение 10 минут с 10 мкМ AKB-9778 сильно усиливала активацию Rap1 (рис.5 D). Блокировка Rap1A и Rap1B одновременно блокировала стимулирующий эффект AKB-9778 на активацию Rac1 (фиг. 5 E). Кроме того, siRNA для Rap1A и Rap1B также блокировали стабилизирующий эффект AKB-9778 на барьерную функцию монослоев HUVEC, зараженных тромбином и определяемых в анализах проницаемости (фиг. 5 F). Экспрессия Rap1 была снижена на 88% с помощью siRNA, как было проанализировано с помощью иммуноблоттинга лизатов HUVEC (фиг. 5 G). Таким образом, AKB-9778 стимулирует Rac1 и стабилизирует контакты с ЭК через Rap1.

Активация Tie-2 мультимерным Ang1, как недавно было обнаружено, вызывает быстрое перераспределение Tie-2 в контакты EC (Fukuhara et al., 2008; Saharinen et al., 2008). Это привлекательная гипотеза, что это перераспределение может участвовать в эффекте стабилизации клеточного контакта. Чтобы проверить это, мы спросили, будет ли AKB-9778 также вызывать перераспределение Tie-2 в клеточных контактах. Мы обнаружили, что 600 нг / мл Comp-Ang1 индуцировал сильное накопление Tie-2 в контактах клеток как в полностью конфлюэнтных, так и в менее конфлюэнтных монослоях HUVEC; однако 5 мкМ AKB-9778 не оказывали такого эффекта (фиг. 6, A и B). В качестве контроля мы обнаружили, что 5 мкМ AKB-9778 и 200 нг / мл и 1 мкг / мл Comp-Ang1 индуцировали фосфорилирование тирозина Tie-2 (фиг.6 С). В соответствии с этим, как AKB-9778, так и Comp-Ang1 эффективно снижали индуцированную тромбином проницаемость монослоев HUVEC для FITC-декстрана 250 кДа (фиг. 6 D).

В совокупности мы пришли к выводу, что ингибирование VE-PTP стабилизирует эндотелиальные соединения посредством активации Rap1, который действует выше активации Rac1, и приводит к снижению немышечного фосфорилирования MLC и образованию волокон радиального стресса. Кроме того, использование этого непрямого способа активации Tie-2 позволило нам показать, что стабилизация контактов EC путем стимуляции активности киназы Tie-2 не требует увеличения или накопления молекул Tie-2 в соединениях EC.Однако это не исключает, что именно Tie-2 в клеточных контактах опосредует усиление контактов через Ang-1.

Чтобы проверить релевантность VE-кадгерина для VE-PTP / Tie-2-индуцированной стабилизации контактов с ЭК, мы создали условных мышей с дефицитом гена Cdh5 , фланкируя экзон 2 (содержащий стартовый кодон) сайтами loxP (рис. 7, А и Б). Гомозиготные Cdh5 ^{lox / lox} мышей, экспрессирующих тамоксифен-индуцибельную Cdh5-iCre ( Cdh5 ^iECKO ) или не Cre , стимулировали в возрасте 7 дней подряд в течение пяти недель подряд тамоксифеном; 2 дня спустя был введен синий Эванс i.v. в течение 30 минут, и экстравазированный краситель определялся в коже, сердце, легких и головном мозге. Мы обнаружили, что инактивация Cdh5 вызывала массивную экстравазацию красителя в легкие и сердце, тогда как утечек в коже и головном мозге не наблюдалось (рис. 7 C). Удаление Cdh5 привело к почти полной потере белка VE-кадгерина в головном мозге, легких, сердце и коже, как это было проанализировано с помощью иммуноблоттинга лизатов тканей (рис. 7, D и E). Не было различий в экспрессии клаудина-5, обнаруживаемой в мозге мышей WT и Cdh5 ^iECKO , что подтверждено иммуноблоттингом лизатов головного мозга (рис.7 D).

Несмотря на резкое увеличение проницаемости сосудов в легких у мышей Cdh5 ^iECKO , эндотелиальные соединения в капиллярах, венулах и артериолах оказались неповрежденными при анализе с помощью электронной микроскопии. Не было обнаружено явных различий между сосудами кожи, сердца, легких и головного мозга (рис. 8А). Точно так же инактивация гена Cdh5 не влияла на среднюю длину соединений (рис.8 C). Таким образом, утечка для адсорбированного белками плазмы Evans blue не сопровождалась ультраструктурными дефектами контактов. Кроме того, гистологический анализ срезов залитых парафином легких не выявил явных сосудистых аномалий или признаков кровотечения (рис. 8 B).

Поскольку сообщалось, что потеря VE-кадгерина приводит к его замене на N-кадгерин в эндотелиальных соединениях (Giampietro et al., 2012), мы проверили, может ли это быть причиной стабильности эндотелиальных соединений в коже.В самом деле, N-кадгерин подвергался усиленной регуляции при обработке тамоксифеном первичных EC, происходящих из кожи мышей Cdh5 ^iECKO (фиг. 9 A), и N-кадгерин заменял VE-кадгерин в местах соединения (фиг. 9 B). Однако инактивация in vivo Cdh5 , подтвержденная окрашиванием целиком (рис. 9 C) и иммуноблотами кожи (рис. 7 E), не привела к замене VE-кадгерина на N-кадгерин в эндотелиальных соединениях. кровеносных сосудов кожи, как показано при окрашивании целиком (рис.9 D). Непостоянное, пятнистое окрашивание некоторых сосудов на N-кадгерин было на базальной поверхности ЭК, совместно с маркером периваскулярных клеток NG2, и было замечено независимо от инактивации Cdh5 (фиг. 9 E). Примечательно, что даже окрашивание β-катенина больше не обнаруживалось при контакте ЭК с кровеносными сосудами кожи после инактивации Cdh5 (рис. 9 F). В сочетании с нашим электронно-микроскопическим анализом это удивительное открытие предполагает, что эндотелиальные соединения, когда они сформированы во взрослых сосудах, могут сохранять свою структуру даже в отсутствие кадгеринов.

Поскольку VE-кадгерин необходим для стабильности эндотелиальных соединений в легких, мы проверили, требуется ли VE-кадгерин для Tie-2-опосредованного стабилизирующего эффекта ингибитора VE-PTP на целостность сосудов в легких. Cdh5 ^iECKO мышей, а для контрольной группы Cdh5 ^{lox / lox} мышей без трансгена Cre лечили тамоксифеном, как описано в предыдущем разделе, и подвергали воздействию ЛПС в виде аэрозоля в течение 40 минут, и проницаемость сосудов была определяется путем инъекции синего Эванса через 4 ч в течение 5 мин.Как показано на фиг. 10А, инактивация Cdh5 увеличивала проницаемость сосудов легких, а воздействие LPS еще больше усиливало экстравазацию синего Эванса. Введение AKB-9778 компенсировало увеличение проницаемости сосудов, вызванное LPS, у мышей Cdh5 ^iECKO . Инактивация гена привела к снижению VE-кадгерина до трудно обнаруживаемых количеств, как было определено иммуноблоттингом лизатов легких для VE-кадгерина (фиг. 10 C). Таким образом, блокирование вызванной воспалением проницаемости сосудов ингибитором VE-PTP AKB-9778 не требует VE-кадгерина.Интересно, что недостаток VE-кадгерина не может быть компенсирован AKB-9778. В соответствии с этим, мы также не могли блокировать эффект увеличения проницаемости i.v. вводили анти-VE-кадгерин mAb BV13 посредством AKB-9778 (фиг. 10B).

Затем мы проверили, будет ли вызванная воспалением экстравазация лейкоцитов усиливаться за счет удаления гена Cdh5 и может ли активация Tie-2 путем ингибирования VE-PTP противодействовать этому эффекту. Cdh5 ^iECKO мышей, а для контрольных мышей Cdh5 ^{lox / lox} мышей лечили тамоксифеном, как описано в предыдущем разделе, и подвергали аэрозольному воздействию ЛПС в течение 40 минут, а через 4 часа нейтрофилы попадали в легкие. были удалены бронхоальвеолярным лаважем и подсчитаны. Мы обнаружили, что инактивация Cdh5 действительно усиливала экстравазацию нейтрофилов (рис. 10 D). AKB-9778 ослаблял LPS-индуцированную экстравазацию нейтрофилов у мышей независимо от того, экспрессировали они VE-кадгерин или нет.Опять же, AKB-9778-триггерная Tie-2-опосредованная стабилизация эндотелиальных соединений не требует VE-cadherin, и это ингибирует рекрутирование нейтрофилов в воспаленное легкое.

Мы показали, что стабилизирующий переходный эффект AKB-9778 основан на активации Rap-1, управляемой Tie-2, который, в свою очередь, активирует Rap-1 (Fig. 5). Чтобы проверить, действительно ли эти эффекты независимы от VE-кадгерина, мы выделили ЭК легких у мышей Cdh5 ^iECKO и обработали их в культуре в течение 54 часов либо 4-гидрокситамоксифеном, либо одним растворителем, с последующим анализом на определение Рэп-1 или Рак-1.Как показано на фиг. 10 (E и F), активация обеих GTPаз с помощью AKB-9778 наблюдалась независимо от присутствия VE-кадгерина. Эффективность инактивации Cdh5 была продемонстрирована иммуноблоттингом клеточных лизатов на VE-кадгерин.

В этом исследовании мы сообщаем о двойной роли VE-PTP в регуляции эндотелиальных соединений и о последствиях для проницаемости сосудов и экстравазации лейкоцитов in vivo.Нарушение активности VE-PTP путем генетической абляции или фармакологического ингибирования с помощью антител к внеклеточному домену или селективного ингибитора фосфатазы AKB-9778, защищенного от индукции проницаемости сосудов различными медиаторами воспаления. Кроме того, ингибирование VE-PTP также блокировало рекрутирование нейтрофилов в легкие мышей, зараженных LPS. Нацеливание на экспрессию Tie-2 позволило нам продемонстрировать следующее: во-первых, что Tie-2 отвечает за защитный эффект ингибирования VE-PTP на целостность сосудов; во-вторых, экспрессия Tie-2 необходима для поддержания базовой целостности стенки сосуда; и в-третьих, отсутствие Tie-2 позволяет ингибированию VE-PTP дестабилизировать эндотелиальные соединения, что подчеркивает поддерживающий эффект VE-PTP для адгезивной функции VE-кадгерина in vivo.Неожиданно наши результаты демонстрируют, что стабилизирующий эффект AKB-9778 на соединениях через Tie-2 перекрывает дестабилизирующий эффект, вызванный ингибированием адгезии, опосредованной VE-кадгерином. Более того, и в соответствии с этим, AKB-9778 может даже стабилизировать эндотелиальные соединения и целостность сосудов в отсутствие VE-кадгерина. Этот стабилизирующий соединение эффект AKB-9778 основан на управляемой Tie-2 активации Rap1, который, в свою очередь, активирует Rac1 и ведет к растворению волокон радиального напряжения.

Хотя AKB-9778 является высокоспецифичным ингибитором каталитической активности VE-PTP (Shen et al., 2014), настоящее исследование является первым, демонстрирующим, что этот ингибитор действительно стабилизирует целостность сосудов посредством VE-PTP и что субстратом, ответственным за этот эффект, является Tie-2. Существенная роль VE-PTP для эффекта AKB-9778 по стабилизации соединений была продемонстрирована, поскольку этот эффект ингибитора больше не наблюдался у мышей Ptprb ^iECKO . Вопрос о том, какой субстрат VE-PTP будет отвечать за эффект стабилизации переходов, важен в свете других субстратов, которые были описаны.Сообщалось, что помимо VE-кадгерина и Tie-2, VE-PTP взаимодействует и влияет на активность VEGFR-2, взаимодействие, которое, как предполагалось, имеет отношение к отрастанию эндотелия (Mellberg et al., 2009; Hayashi et al. др., 2013). Более того, другие рецепторы тирозинкиназ были описаны как возможные субстраты на основе связывания с мутантом, улавливающим фосфатазу (Sakuraba et al., 2013). В этом контексте важно, что экспрессия Tie-2 действительно необходима для стабилизирующего действия AKB-9778 на эндотелиальные соединения.

Несколько субстратов VE-PTP, вероятно, будут вовлечены в дестабилизирующее соединение действие AKB-9778 в условиях низкой или нулевой экспрессии Tie-2. Это сам VE-кадгерин и плакоглобин (Nottebaum et al., 2008; Wessel et al., 2014) и VEGFR-2 (Hayashi et al., 2013), которые участвуют в регуляции соединений. Являются ли другие потенциальные субстраты VE-PTP (Sakuraba et al., 2013) релевантными для стабилизирующего действия VE-PTP на эндотелиальные соединения, в настоящее время неизвестно.

Стимуляция Tie-2 с помощью Ang-1 защищает сосудистую сеть от утечки плазмы (Gamble et al., 2000; Thurston et al., 2000). Были предложены различные сигнальные механизмы, обеспечивающие этот эффект. Было показано, что Ang-1 запускает активацию RhoA, которая вызывает секвестрацию Src с помощью mDia и тем самым ингибирует VEGF-индуцированное фосфорилирование VE-кадгерина и эндоцитоз (Gavard et al., 2008). В соответствии с этим сообщалось, что Ang1 запускает рекрутирование RhoA-специфического GEF Syx в эндотелиальные соединения, что поддерживает RhoA-опосредованную активацию mDia (Ngok et al., 2012). Другие сообщили, что стимуляция Tie-2 приводит к активации Rac1, который запускает через p190RhoGAP дезактивацию RhoA, что, в свою очередь, блокирует перестройки актинового цитоскелета, вызванные медиаторами воспаления (Mammoto et al., 2007; David et al., 2011). Наши результаты согласуются с последними исследованиями. AKB-9778-опосредованная стимуляция Tie-2 активирует Rac1 и растворяет образование основанных на актомиозине радиальных стрессовых волокон, снимая напряжение на эндотелиальных соединениях.С активацией Rap1 мы идентифицировали важный шаг выше Rac1, с помощью которого Tie-2 стабилизирует эндотелиальные соединения. Помимо Rac-1, Rap-1 также может более непосредственно модулировать активность RhoA посредством RhoGAP ArhGAP29 (Post et al., 2013).

Активация Rap1, хотя до сих пор неизвестна как сигнальная мишень Tie-2, хорошо известна как сигнальный этап, который ведет к усилению эндотелиальных соединений.Это достигается двумя «параллельными» путями, растворением радиальных стрессовых волокон посредством подавления пути Rho-Rock-немышечный миозин II и образованием кольцевых актиновых пучков посредством активации Cdc42 (Ando et al., 2013). Оба эти эффекта на радиальные стрессовые волокна и периферические актиновые филаменты наблюдались с AKB-9778 в HUVECs (Fig. 5). Разумно предположить, что эти эффекты могут усиливать адгезионную активность VE-кадгерина, и действительно было очень убедительно продемонстрировано, что активация Rap1 усиливает опосредованную VE-кадгерином целостность эндотелиального соединения (Fukuhara et al., 2005; Kooistra et al., 2005; Мотидзуки, 2009). Примечательно, однако, что наши результаты показывают, что опосредованные Tie-2 / Rap1 эффекты на актомиозиновый цитоскелет способны даже усиливать эндотелиальные соединения в отсутствие VE-кадгерина. Наши результаты не противоречат механизмам, с помощью которых передача сигналов Tie-2 / Rap1 усиливает VE-cadherin-обеспечиваемую адгезию, но они предполагают, что этот путь передачи сигналов не важен для стабилизации эндотелиальных соединений посредством стимуляции Tie-2 in vivo.

Было продемонстрировано, что Ang1 запускает перераспределение Tie-2 вместе с VE-PTP в эндотелиальные соединения в эндотелиальных монослоях, тогда как разбросанные мобильные ЭК накапливают Tie-2 в контактах с клеточным матриксом (Fukuhara et al., 2008; Saharinen et al., 2008). Эти исследования установили, что разные сигнальные комплексы Tie-2 рекрутируются в разные сайты в покоящихся и мобильных клетках. Это объясняет, как Tie-2 удается стимулировать различные сигнальные пути при покое сосудов и ангиогенезе. Наши результаты демонстрируют, что перераспределение Tie-2 в клеточные контакты не запускается автоматически при активации активности киназы Tie-2, но требует связывания Ang-1.

Тот факт, что стимуляция Tie-2 ингибитором VE-PTP AKB-9778 стабилизирует зараженные эндотелиальные соединения даже в отсутствие VE-кадгерина, заслуживает внимания по крайней мере по двум причинам.Во-первых, это объясняет, почему отрицательный эффект AKB-9778 на адгезивную функцию VE-PTP-ассоциированного VE-cadherin не ставит под угрозу способность AKB-9778 усиливать целостность соединения посредством Tie-2. Во-вторых, наши результаты показывают, что открытие эндотелиальных соединений, вызванное воспалением, является двухступенчатым механизмом. Это действительно требует снижения адгезивной функции VE-кадгерина, как было показано ранее для мутантных мышей, экспрессирующих либо слитый белок VE-кадгерин-α-катенин, либо мутанты тирозина VE-кадгерина, заменяющие эндогенный VE-кадгерин (Schulte et al. al., 2011; Wessel et al., 2014). Помимо ослабления адгезивной целостности эндотелиальных соединений и независимо от этого, воспалительные стимулы открывают эндотелиальные соединения за счет усиления опосредованных актомиозином сил натяжения на контактах клеток. Активация Tie-2, индуцированная AKB-9778, может аннулировать этот эффект. Было неожиданным, что вызванные воспалением эффекты на актомиозиновый цитоскелет дополнительно усиливали открытие эндотелиальных соединений даже в отсутствие VE-кадгерина. Сходным образом интересно, что подавление образования радиальных стрессовых волокон посредством активации Rap1 может все еще стабилизировать вызываемые эндотелиальные соединения, даже когда VE-cadherin отсутствует.

VE-cadherin очень хорошо зарекомендовал себя как адгезионная молекула, имеющая доминирующее значение для образования и стабильности эндотелиальных соединений (Dejana and Vestweber, 2013). Поэтому мы были удивлены, не наблюдая образования утечек в коже и головном мозге, несмотря на эффективную инактивацию гена Cdh5 даже через 7 дней после начала экспрессии Cre. В соответствии с этим, антитела против VE-кадгерина увеличивали проницаемость сосудов в легких и сердце в течение нескольких часов, но не оказывали влияния на кожу и мозг (Corada et al., 1999). Однако отсутствие индуцированного антителами образования утечки в коже и головном мозге могло быть вызвано недостаточной доступностью VE-кадгерина для антител. Настоящие результаты позволяют обойти это ограничение. Однако мы не можем полностью исключить, что утечка низкого уровня содержания плазмы может происходить в течение более длительных периодов времени. Фактически, через 17-20 дней после начала экспрессии Cre мы обнаружили образование отека в дерме (неопубликованные данные). Это могло быть вызвано либо незначительными дефектами соединения, либо недостаточной функцией сердца.

Мыши с инактивированными геном Cdh5 выжили не менее 20 дней. Это демонстрирует, что плотные соединения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) не были сильно затронуты и что поддержание целостности ГЭБ не требует VE-кадгерина. Для сравнения: Cldn5 ^{— / —} мыши погибают в течение 10 часов после рождения в результате дефектного ГЭБ (Nitta et al., 2003). В соответствии с этим мы обнаружили нормальные уровни клаудина-5 в лизатах мозга мышей Cdh5 ^iECKO на 7 день после начала экспрессии Cre.Поскольку отсутствие VE-кадгерина, как сообщается, вызывает потерю экспрессии клаудина-5 в культивируемых ЭК и во фрагментах эндотелиальных кластеров, которые сформировались в культурах эксплантатов аллантоиса Cdh5 ^{— / —} мышей (Taddei et al., 2008) , мы предполагаем, что VE-cadherin важен для экспрессии claudin-5 в новообразованных сосудах, которые устанавливают межклеточные контакты, тогда как полностью сформировавшиеся кровеносные сосуды не нуждаются в VE-cadherin для поддержания экспрессии claudin-5 и целостности плотных соединений.

Мы не обнаружили явных дефектов эндотелиальных соединений у мышей Cdh5 ^iECKO с помощью ультраструктурного анализа срезов сосудов кожи и головного мозга. Даже эндотелиальные соединения легких и сердца выглядели в основном нормально, несмотря на повышенную утечку белков плазмы. Мы можем исключить, что другой кадгерин компенсировал потерю VE-кадгерина в кровеносных сосудах кожи, потому что мы не смогли обнаружить ни N-кадгерин, ни β-катенин в эндотелиальных соединениях в цельных образцах кожи.Напротив, in vitro мы обнаружили, что N-кадгерин активируется в культивируемых первичных ECs после инактивации Cdh5 и обнаруживается на стыках, в соответствии с предыдущим исследованием (Giampietro et al., 2012). Мы пришли к выводу, что in vivo потеря VE-кадгерина в полностью сформировавшихся кровеносных сосудах взрослой кожи не компенсируется другими кадгеринами. Таким образом, примечательно, что эндотелиальные адгезивные соединения в сформировавшихся кровеносных сосудах кожи и мозга могут сохраняться в отсутствие кадгеринов.Кроме того, повышенная базальная проницаемость для белков плазмы в легких и сердце, вызванная отсутствием VE-кадгерина, сопровождается не полным разрушением соединений, а скорее более тонкой дестабилизацией, которая не соответствует повреждению, которое можно было бы обнаружить с помощью электронной микроскопии. .

В заключение, наши результаты подчеркивают важность и взаимосвязь VE-кадгерина, Tie-2 и VE-PTP как регуляторов эндотелиальных соединений и целостности сосудов in vivo.Мы показываем, что ингибирование VE-PTP, хотя и блокирует его поддержку связанного VE-cadherin, усиливает целостность соединения посредством Tie-2. Этот последний эффект основан на Rap1, который стимулирует растворение волокон радиального напряжения и может поддерживать укрепление соединения даже в отсутствие VE-кадгерина. Наши результаты показывают, что ослабление эндотелиальных соединений, вызванное воспалением, представляет собой двухэтапный процесс, который требует нацеливания на VE-кадгерин и / или ассоциированные белки (Schulte et al., 2011; Wessel et al., 2014) плюс вмешательство в систему актомиозина. Последний из этих эффектов ослабляется активацией Tie-2. Нацеливание на VE-кадгерин необходимо, но не всегда достаточно для открытия эндотелиальных соединений in vivo, поскольку инактивация гена VE-кадгерина оказывала только сильное влияние на стабильность соединений в органах, подвергшихся сильному механическому воздействию, таких как легкие и сердце. Особенно удивила стабильность BBB через несколько недель после инактивации гена VE-кадгерина. Эта неожиданная стабильность эндотелиальных соединений в отсутствие VE-кадгерина может быть объяснена структурами, обеспечивающими стабильность, такими как базальная мембрана и периваскулярные клетки в сформировавшихся кровеносных сосудах взрослых.Кроме того, другие молекулы адгезии могут иметь отношение к стабильности эндотелиальных соединений в дополнение к VE-кадгерину. Раскрытие их личности будет интересной целью на будущее.

HUVEC культивировали в среде EBM-2 с добавлением SingleQuots (Lonza). Первичные ЭК из легких мышей дикого типа или мышей с инактивированными генами выделяли и культивировали, как описано ранее (Schulte et al., 2011).Для выделения ЭК из кожи хвосты отрезали у основания и переносили в стерильный HBSS / 1% Pen / Strep перед тем, как кожу с хвостов удаляли и разрезали на фрагменты длиной 20 мм. Фрагменты инкубировали в 5% Dispase / PBS в течение 60 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании для отделения эпидермиса от дермы. Кожные фрагменты промывали HBSS / 1% Pen / Strep, переносили в раствор коллагеназы A (Roche) и обрабатывали, как для выделения ЭК легких.

Человеческие Т-клетки были выделены из периферической крови человека с использованием набора Dynabeads Untouched Human T Cells (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя и предварительно активированы в течение 2–5 дней в Т-клеточной среде (RPMI, 20% FCS, 2% глутамин, 1% пенициллин / стрептомицин, 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот и 0.1% β-меркаптоэтанол), содержащий 10 нг / мл рекомбинантного человеческого IL2 (PeproTech) и 2 мкг / мл Phytohemagglutinin-M (Roche). ПМЯ из крови человека выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Histopaque 1077 и 1119 (Sigma-Aldrich). Фазу, содержащую гранулоциты, удаляли, и клетки дважды промывали промывочным буфером (HBSS ^{— / —} , 25 мМ Hepes, pH 7,3 и 10% FCS) перед тем, как эритроциты лизировали путем инкубации в 0,15 М NH ₄ Cl. , 1 мМ KHCO ₃ и 0,1 мМ Na ₂ EDTA в течение 4 мин при комнатной температуре.PMN использовали для анализа трансмиграции сразу после выделения.

Ингибитор VE-PTP AKB-9778 (Aerpio Therapeutics) использовали в виде 10 мМ (6,07 мг / мл) исходного раствора в 5% глюкозе / H ₂ O. Были использованы следующие дополнительные реагенты: рекомбинантный человеческий TNF (PeproTech). ), IL-8 (R&D Systems), мышиный и человеческий VEGF165 (PeproTech), человеческий тромбин (EMD Millipore), гистамин (Sigma-Aldrich), COMP-Ang1 (G.Y. Koh), желатин (Sigma-Aldrich), флуоресцентная монтажная среда (Dako), 250 кДа FITC-декстран (Sigma-Aldrich) и Dispase (Roche), 4-гидрокситамоксифен (Sigma-Aldrich) и тамоксифен (Sigma- Олдрич).

Использовали следующие антитела: pAb VE42 (Broermann et al., 2011) и pAb C5 против мышиного VE-кадгерина (Gotsch et al., 1997), pAb против человеческого VE-кадгерина (C-19; Santa Cruz Biotechnology, Inc. .), мышиный pAb PTP 1-8 против внеклеточных фибронектиновых доменов типа III 1-8 VE-PTP (Winderlich et al., 2009), pAb VE-PTP-C против VE-PTP (Nawroth et al., 2002), mAb против PECAM-1 (1G5.1 и 5D2.6; Wegmann et al., 2006), pAb против PECAM-1 (M-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), mAb против N-кадгерина (32 / N-кадгерин; BD), mAb против β-катенина (14 / β-catenin; BD), mAb против плакоглобина (15 / γ -катенин; BD), mAb против α-катенина (5 / α-catenin; BD), mAb против p120-катенина (98 / pp120; BD), pAb против β-катенина (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), mAb против фосфотирозин (4G10; Merck Millipore), mAb против α-тубулина (B-5-1-2; Sigma-Aldrich), mAb 3G1 против Tie-2 (Koblizek et al., 1997), mAb против Tie-2 человека (Tek33.3; Merck Millipore), pAb против pMLC-2 (Cell Signaling Technology), pAb против Claudin-5 (Invitrogen), pAb против NG2 (Merck Millipore), mAb против Rac1 (102 / Rac1; BD), pAb против Rap1 (Merck Millipore), mAb против мышиного эндомуцина (V7C7.1; Morgan et al., 1999), pAb против ICAM-1 (M-19; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) , mAb против человеческого Tie-2 (D9D10; Cell Signaling Technology), pAb против Src-pY418 (Life Technologies), pAb против c-Src (SRC2; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), mAb против VEGFR-2 (55B11; Cell Signaling Technology) и фаллоидин – Alexa Fluor 568 или –Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Вторичные антитела были приобретены у Dianova. Антитела, связанные с Alexa Fluor 488–, Alexa Fluor 568– и Alexa Fluor 647, были приобретены у Invitrogen.

Для коиммунопреципитации клетки лизировали в буфере для лизиса (20 мМ имидазол, pH 6,8, 100 мМ NaCl, 2 мМ CaCl ₂ , 1% Triton X-100, 0.04% NaN ₃ и 1 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА [Roche]). Для обнаружения фосфотирозина после иммунопреципитации клетки лизировали в буфере для лизиса, содержащем 20 мМ трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl ₂ , 1 мМ Na ₃ VO ₄ , 1% тритона. X-100, 0,04% NaN ₃ и 1 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА (Roche). Для иммунопреципитации белков из лизатов легких мышей легкие гомогенизировали с помощью Ultra Turrax (IKA-Werke) в буфере RIPA, содержащем 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 0.01 М NaPi, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na ₃ VO ₄ и 2 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА, с последующей инкубацией в течение 4 ч при 4 ° C. Лизаты центрифугировали при 4 ° C в течение 1 часа при 20000 g , а затем аликвоты откладывали для прямого блот-анализа, а аликвоты для иммунопреципитации предварительно очищали в течение 2 часов при 4 ° C с протеином A / G-сефарозой и затем инкубировали. в течение 3 ч при 4 ° C с протеином A / G-Sepharose, загруженным соответствующими антителами. Иммунокомплексы промывали пять раз буфером для лизиса и анализировали с помощью SDS-PAGE.Общие лизаты клеток или органов или иммунопреципитированный материал разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозу (Schleicher & Schuell) влажным блоттингом. Блоты анализировали, как описано ранее (Ebnet et al., 2000). Для обнаружения фосфорилированного тирозина сухое молоко в блокирующем буфере заменили на 2% BSA и добавили 200 мкМ Na ₃ VO ₄ .

% PDF-1.3 % 1 0 объект > / XObject 154 0 R / ProcSet 153 0 R >> / Содержание [151 0 R 149 0 R 147 0 R 145 0 R 143 0 R 141 0 R 139 0 R 137 0 R] / MediaBox [0 0 623 863] / CropBox [0 0 623 863] / Повернуть 0 >> эндобдж 6 0 obj > / XObject 204 0 R / ProcSet 203 0 R >> / Содержание [201 0 199 0 р. 197 0 р. 195 0 р. 193 0 р. 191 0 р. 189 0 р. 187 0 р.] / MediaBox [0 0 623 862] / CropBox [0 0 623 862] / Повернуть 0 >> эндобдж 11 0 объект > / XObject 256 0 R / ProcSet 255 0 R >> / Содержание [253 0 R 251 0 R 249 0 R 247 0 R 245 0 R 243 0 R 241 0 R 239 0 R] / MediaBox [0 0 623 864] / CropBox [0 0 623 864] / Повернуть 0 >> эндобдж 16 0 объект > / XObject 306 0 R / ProcSet 305 0 R >> / Содержание [303 0 R 301 0 R 299 0 R 297 0 R 295 0 R 293 0 R 291 0 R 289 0 R] / MediaBox [0 0 622 860] / CropBox [0 0 622 860] / Повернуть 0 >> эндобдж 21 0 объект > / XObject 356 0 R / ProcSet 355 0 R >> / Содержание [353 0 R 351 0 R 349 ​​0 R 347 0 R 345 0 R 343 0 R 341 0 R 339 0 R] / MediaBox [0 0 634 866] / CropBox [0 0 634 866] / Повернуть 0 >> эндобдж 26 0 объект > / XObject 408 0 R / ProcSet 407 0 R >> / Содержание [405 0 R 403 0 R 401 0 R 399 0 R 397 0 R 395 0 R 393 0 R 391 0 R] / MediaBox [0 0 634 866] / CropBox [0 0 634 866] / Повернуть 0 >> эндобдж 31 0 объект > / XObject 460 0 R / ProcSet 459 0 R >> / Содержание [457 0 R 455 0 R 453 0 R 451 0 R 449 0 R 447 0 R 445 0 R 443 0 R] / MediaBox [0 0 622 862] / CropBox [0 0 622 862] / Повернуть 0 >> эндобдж 36 0 объект > / XObject 510 0 R / ProcSet 509 0 R >> / Содержание [507 0 R 505 0 R 503 0 R 501 0 R 499 0 R 497 0 R 495 0 R 493 0 R] / MediaBox [0 0 625 861] / CropBox [0 0 625 861] / Повернуть 0 >> эндобдж 41 0 объект > / XObject 562 0 R / ProcSet 561 0 R >> / Содержание [559 0 R 557 0 R 555 0 R 553 0 R 551 0 R 549 0 R 547 0 R 545 0 R] / MediaBox [0 0 612 857] / CropBox [0 0 612 857] / Повернуть 0 >> эндобдж 46 0 объект > / XObject 612 0 R / ProcSet 611 0 R >> / Содержание [609 0 R 607 0 R 605 0 R 603 0 R 601 0 R 599 0 R 597 0 R 595 0 R] / MediaBox [0 0 612 857] / CropBox [0 0 612 857] / Повернуть 0 >> эндобдж 51 0 объект > / XObject 662 0 R / ProcSet 661 0 R >> / Содержание [659 0 R 657 0 R 655 0 R 653 0 R 651 0 R 649 0 R 647 0 R 645 0 R] / MediaBox [0 0 613 858] / CropBox [0 0 613 858] / Повернуть 0 >> эндобдж 56 0 объект > / XObject 731 0 R / ProcSet 730 0 R >> / Содержание 695 0 руб. / MediaBox [0 0 865 610] / CropBox [0 0 865 610] / Повернуть 0 >> эндобдж 61 0 объект > / XObject 800 0 R / ProcSet 799 0 R >> / Содержание 764 0 руб. / MediaBox [0 0 613 858] / CropBox [0 0 613 858] / Повернуть 0 >> эндобдж 66 0 объект > / XObject 850 0 R / ProcSet 849 0 R >> / Содержание [847 0 R 845 0 R 843 0 R 841 0 R 839 0 R 837 0 R 835 0 R 833 0 R] / MediaBox [0 0 865 611] / CropBox [0 0 865 611] / Повернуть 0 >> эндобдж 71 0 объект Топливо для LMFBR мощностью 1000 МВт (эл.).Октябрь 1988 г.
К. Кавасима, Р.А. К \ aram
Сессия B 1.1: 31-е совещание NEACRP) / CreationDate (D: 199000000) / ModDate (D: 20050128121819 + 01’00 ‘) / Производитель (Tiff2PDF V2.4.C — Windows) / Creator (подключаемый модуль Acrobat 4.0 Capture для Windows

3-Methylcyclohex-2-en-1-one для защиты территорий и отдельных деревьев от еловых жуков (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) в южной части Скалистых гор | Journal of Economic Энтомология

Аннотация

Мы протестировали 3-метилциклогекс-2-ен-1-он (MCH) и смесь кайромона Acer (AKB) в качестве репеллентных полухимических веществ для защиты территорий и отдельных деревьев для предотвращения нападений елового жука ( Dendroctonus rufipennis Kirby) в определенных местах. в Юте и Нью-Мексико.В исследовании защиты территории мы сравнили уровни заражения хозяевами внесения MCH при трех плотностях (20, 40 и 80 г MCH га ^–1 ) с контрольной обработкой на участках 0,64 га, сосредоточенных в блоках обработки ~ 1,25 га. Все обработки включали две ловушки-воронки с наживкой на участке для обеспечения давления еловых жуков. После нападения жуков участки были обследованы на предмет новых нападений жуков-еловых и для количественной оценки характеристик насаждений. Вероятность более серьезных нападений еловых жуков была значительно снижена, примерно на 50%, в каждой из обработок зоны MCH по сравнению с контрольной обработкой, но не было существенной разницы между плотностями размещения MCH.Для исследования защиты одного дерева мы сравнили скорость атаки MCH, Acer смеси кайромонов (AKB) и MCH плюс AKB на деревьях с наживкой на еловых жуков против деревьев, содержащих только наживку. Каждое лечение применялось в диапазоне диаметров хозяина для проверки влияния размера хозяина. Семьдесят пять процентов контрольных деревьев подверглись массовому нападению, около одной трети ели только MCH и AKB подверглись массовому нападению, и ни одна ель MCH плюс AKB не подверглась массовому нападению. Эти результаты предполагают, что один только MCH является маргинальной областью и средством защиты отдельных деревьев от елового жука, но использование других репеллентов может значительно повысить эффективность лечения.

Еловый жук, Dendroctonus rufipennis Кирби (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae), является наиболее важным возбудителем нарушений у североамериканских видов елей. Например, продолжающаяся вспышка в Колорадо поразила около 0,7 миллиона гектаров ели Энгельмана, Picea engelmannii, Parry ex Engelm (Colorado State Forest Service, 2016). Жизненный цикл колеблется от 1 до 3 лет в зависимости от местных температур, при этом большинство атак на новых хозяев происходит в начале лета (Holsten et al.1999). Еловый жук предпочитает поваленные деревья-хозяева на уровне эндемичных популяций. Вспышки, поражающие живые стоящие деревья, часто возникают в результате роста популяции в результате широкомасштабного ветровоза, усугубляемого такими факторами, как высокая восприимчивость древостоя и благоприятная погода, последние сокращают продолжительность жизненного цикла и зимнюю смертность жуков (Reynolds and Holsten 1994). Ель большего диаметра (например, диаметр> 40 см на высоте груди [dbh]) предпочтительно поражается во время вспышек, когда самки откладывают более 100 яиц в вертикальных галереях во флоэме хозяина.Личинки питаются горизонтально, поедая флоэму хозяина. Иногда колонизируется только одна поверхность штамба, создавая «полосовую атаку», при которой дерево остается живым, если массовые нападения не произойдут в следующем году (Holsten et al. 1999). Как и в случае с другими видами Dendroctonus , хеморецепция имеет решающее значение для идентификации подходящих хозяев, поиска партнеров и привлечения сородичей для преодоления защиты хозяина посредством массовой атаки (Jenkins et al. 2014).

Варианты управления включают косвенный контроль через управление растительностью (т.е., прореживание деревьев для увеличения силы роста деревьев и разнообразия классов по размеру и возрасту) и стратегии прямого подавления, такие как превентивная обработка инсектицидами, удаление или сжигание зараженных деревьев, отлов с помощью воронкообразных ловушек или деревьев-хозяев с наживкой, а также полуохимические репелленты (Bentz and Munson, 2000). , Fettig et al.2007, Hansen et al.2010, Munson 2010, Windmuller-Campione and Long 2015, Fettig and Hilszczański 2015). Семиохимические стратегии используют обонятельные связи жуков-еловых, привлекая жуков к ловушкам или отталкивая их от потенциальных хозяев.Обоснование выбора среди этих стратегий будет зависеть от таких факторов, как бюджетные ограничения, стоимость ресурсов, местоположение и размер вспышки, цели управления и экологические проблемы.

Полухимические репелленты могут использоваться для уменьшения или прекращения притяжения короедов к деревьям и могут быть эффективным инструментом управления (Samman and Logan 2000). Более того, эта стратегия может быть единственным вариантом для территорий с ограничениями на вырубку леса или применение пестицидов. Кроме того, пассивные полухимические устройства для высвобождения очень портативны, что позволяет использовать их в районах, где отсутствует доступ к дорогам, не имеют известных нецелевых эффектов по сравнению с инсектицидами и часто менее дороги, чем альтернативные стратегии контроля.

3-Метилциклогекс-2-ен-1-он (MCH) представляет собой полуохимический репеллент, обнаруженный у елового жука (Rudinsky et al.1974), и предыдущие исследования показали, что MCH снижает привлекательность елового жука к бревнам, зараженным самками (Kline и др., 1974; Фурнисс и др., 1976), ловушки с наживкой с синтетическими семиохимическими приманками (Фурнисс и др., 1976; Линдгрен и др., 1989), пнями, ветрометом и срубленными штамбами (Рудинский и др., 1974, Фурнисс и др. 1976, Дайер и Холл 1977, Линдгрен и др. 1989). MCH часто используют для сокращения численности жука пихты Дугласовой ( D.pseudotsugae Hopkins) нападает на пихту Дугласа ( Pseudotsuga menziesii [Mirb.] Franco), полностью останавливая заражение в некоторых испытаниях, несмотря на наличие ловушек с наживкой (Ross and Wallin 2008, Brookes et al. 2016). Однако результаты были неоднозначными в испытаниях с использованием MCH для защиты живых стоячих елей от нападения еловых жуков. Испытания оказались безуспешными при использовании устройств с пассивным высвобождением (2–10 мг MCH в день ^–1 при 22–25 ° C) для защиты отдельных деревьев и территорий на Аляске (Werner and Holsten, 1995) и защиты территорий в Юте (Ross et al.2004 г.).

В первом успешном исследовании использовались насосы для микроинфузии в качестве высвобождающего устройства (2,6–5,0 мг MCH в день ^–1 независимо от температуры), что привело к снижению на 80–87% скорости заражения хозяевами на всей территории по сравнению с контрольными участками на Аляске ( Холстен и др., 2003). В недавнем испытании MCH для уменьшения атак еловых жуков использовалось пассивное устройство с высоким высвобождением (пузырь 1000 мг, элюирование 12 мг MCH в день ^–1 при 25 ° C, Synergy Semiochemicals Corp., Бернаби, Британская Колумбия, Канада) в сочетании с семиохимический изофорон (1800 мг пузырь, элюирование 6.5 мг в день ^–1 при 25 ° C) и сулькатон (1700 мг в пузырьках, элюирование 35 мг в день ^–1 при 25 ° C) (Hansen et al., 2016). Хотя исследование было сосредоточено на эффектах обработки пестицидами для подавления популяции еловых жуков и нападений на живых хозяев, результаты показали, что репелленты могут быть эффективными в качестве средства защиты территории. Ель Энгельмана на участках, которые включали эти репелленты, имела значительно меньшую вероятность нападения жуков по сравнению с аналогичным образом обработанными участками без репеллентов (Hansen et al.2016).

Наша цель состояла в том, чтобы определить эффективность MCH и другого полухимического репеллента в качестве обработки местности и отдельных деревьев для уменьшения нападений еловых жуков. Полевые исследования проводились в трех южных районах Скалистых гор, где наблюдалась разная популяционная нагрузка еловых жуков. Мы использовали то же пассивное устройство MCH с высоким высвобождением, что и Hansen et al. (2016) для проверки защиты отдельных деревьев и территорий. MCH был развернут с тремя плотностями в качестве обработок для защиты территории. Мы также использовали смесь кайромонов (AKB) Acer (род кленов) на отдельных деревьях, отдельно и в паре с MCH.AKB ранее был протестирован в исследовании биотеста по отловам в Юте, и было обнаружено, что он снижает уловы еловых жуков на ~ 80% по сравнению с контрольным препаратом (неопубликованные данные Э. М. Хансен, А. С. Мансон и Д. Вакарчук).

Материалы и методы

Описание района исследования

исследовательских участка были обнаружены в округе Рейнджеров Дюшен / Рузвельт, Национальном лесу Эшли, Юта («Милл-Парк»), округе Бивер-Рейнджер, Национальном лесу Фишлейк, Юта («Большая квартира») и районе Рейнджеров Трес-Пьедрас, Национальный лес Карсон. , Нью-Мексико («Озеро Хоупвелл») (рис.1). Наши критерии поиска включали участки с активными популяциями еловых жуков (оцененные с помощью карт аэрофотосъемки (ADS) и подтвержденные наземной разведкой) и восприимчивые еловые насаждения Энгельмана, которые включали живые деревья большого диаметра (≥40 см dbh) (Таблица 1). В районе Милл-Парка наблюдались популяции эпидемических жуков (две группы из пяти или более зараженных деревьев на каждые 2 га; Bentz and Munson 2000, Hansen et al.2006), а в районах Биг-Флэт и озера Хоупвелл наблюдались строительные популяции (> 2 зараженных деревьев на каждые 2 га).По данным ADS, проведенного в 2015 году Лесной службой США и службой охраны здоровья лесов, в пределах 5 км от центра Милл-Парка насчитывалось 5400 увядающих елей (с желто-зелеными иголками) по сравнению с 200 увядающими елями в пределах 5 км от центра. района Биг Флэт (ADS фиксирует, что хвоя ели выцветает через год после заражения). ADS не обнаружила смертность от жуков-еловых в пределах 5 км от озера Хоупвелл, хотя полигон смертности имелся примерно в 5 км от самых северных участков.Ели возле озера Хоупвелл были сильно дефолиированы еловыми почковыми червями, Choristoneura occidentalis Freeman, что затруднило идентификацию убитых жуками деревьев с воздуха. Трибуны в Милл-парке были частично вырублены ок. 1960 г., способствуя появлению деревьев относительно меньшего среднего диаметра и более низкой базальной площади (BA) (Таблица 1).

Рис. 1.

Расположение участков для обработки территории, установленных в «Биг Флэт» (округ Бивер-Рейнджер, Национальный лес Фишлейк, штат Юта), «Милл-Парк» (округ Дюшен / Рузвельт-Рейнджер, Национальный лес Эшли, штат Юта) и « Озеро Хоупвелл »(район рейнджеров Трес-Пьедрас, национальный лес Карсон, Нью-Мексико).Обработанные площади составляли ~ 1,25 га квадратов с площадью 0,64 га в центре. Контрольные участки обведены синим цветом, участки, обработанные MCH, развернутые на площади 20 г га ⁻¹ (интервал 22,4 м) выделены желтым, участки обработанные MCH выделены на площади 40 г га ⁻¹ (интервал 15,8 м) выделены оранжевым цветом, а участки, обработанные MCH, площадью 80 г га ^–1 (расстояние 11,2 м) обведены красным. Деревья, использованные в индивидуальных испытаниях защиты деревьев, находились в непосредственной близости от каждого из трех мест.

Рис. 1.

Расположение участков для обработки территории, установленных в «Биг Флэт» (округ Бивер-Рейнджер, Национальный лес Фишлейк, штат Юта), «Милл-Парк» (округ Дюшен / Рузвельт-Рейнджер, Национальный лес Эшли, штат Юта) и «Озеро Хоупвелл» (Район рейнджеров Трес-Пьедрас, национальный лес Карсон, Нью-Мексико). Обработанные площади составляли ~ 1,25 га квадратов с площадью 0,64 га в центре. Контрольные участки обведены синим цветом, участки, обработанные MCH, развернутые на площади 20 г га ⁻¹ (расстояние 22,4 м) обведены желтым, участки обработанные MCH, развернутые на площади 40 г га ⁻¹ (15.С шагом 8 м) обведены оранжевым, а участки, обработанные MCH, площадью 80 г га ^-1 (с шагом 11,2 м) обведены красным. Деревья, использованные в индивидуальных испытаниях защиты деревьев, находились в непосредственной близости от каждого из трех мест.

, по площади, для каждой обработки в пределах квадратных делянок 80 × 80 м (0,64 га)

Характеристики стенда предварительной обработки, по площади, для каждой обработки в пределах квадратов 80 × 80 м (0.64 га)

Охрана территории

Для испытаний защиты территорий мы использовали MCH (1000 мг пузырь, элюирование 12 мг в день ^–1 при 25 ° C; Synergy Semiochemicals Corp) при 20 (22.С шагом 4 м), 40 (с шагом 15,8 м) и 80 (с шагом 11,2 м) г га ^–1 . Это высвобождающее устройство имеет как минимум вдвое большую загрузку и скорость высвобождения МСН по сравнению с устройствами, которые успешно использовались против жука дугласовой пихты в течение многих лет (пузырьки 400-500 мг, элюирование 3,8-5 мг в сутки ^–1 при 20–20 ° С). 25 ° C; Росс и Валлин, 2008 г., Брукс и др., 2016 г.). MCH был прикреплен скобами к северным сторонам стволов на высоте около 2 м над уровнем земли (рис. 2). Для достижения равномерного буферного расстояния от края обработки до исследуемого участка (0.64 га) край среди всех междурядий, блоки обработки составили ~ 1,25 га (рис. 2). Участки располагались на расстоянии> 30 м друг от друга, а обработки назначались случайным образом с блокированием повторов внутри насаждений, где это возможно (рис. 1). Минимальное расстояние было ближе, чем мы предпочитали, но было необходимо из-за отсутствия доступных насаждений, отвечающих нашим критериям, в сочетании с необходимостью однородных условий в каждой повторности. Мы понимаем, что перенос семиохимикатов ветром мог повлиять на близлежащие участки на этом расстоянии. Этот недостаток был устранен за счет наличия буфера между краями блока обработки и измерения (рис.2), что привело к минимальному расстоянию между мерными блоками ~ 60 м. Для справки, MCH в системах жуков Дугласа и пихты имеет эффективный диапазон действия репеллента до ~ 30 м в зависимости от скорости высвобождения в одной точке. Например, семь совместно расположенных устройств MCH (высвобождающий агент на 500 мг, каждое элюирующее 5 мг на день ^–1 при 25 ° C, всего 35 мг на день ^–1 ), расположенных на сетке 31 м, были столь же эффективны в ингибировании Жук Дугласовой пихты атакует одиночными устройствами (5 мг на день ^–1 ), расположенными на 12-метровой сетке (Brookes et al.2016). В другом исследовании Ross et al. (2002) обнаружили, что три высвобождения MCH по 2 мг на день ^–1 , расположенные на расстоянии 15 м, значительно снижали уровень заражения жуком пихты Дугласа по сравнению с контрольными участками, но девять высвобождающих веществ (18 мг MCH d ^–1 ), расположенных на расстоянии 44 м, вызывали заражение. ставки неотличимы от таковых в элементах управления. Таким образом, данные по системам жуков Дугласа и пихты предполагают, что смертность деревьев, вызванная жуками, была минимально изменена в нашем исследовании, если вообще изменилась, особенно с учетом того, что недавно зараженная БА была в целом аналогичной в рамках обработок в каждом из трех мест исследования (т.е., обработки имели аналогичное давление жуков на делянке; Таблица 1).

Рис. 2.

Диаграммы обработок территорий с использованием МКН для снижения нападения ельников на живую ель. Пунктирные линии представляют блок обработки ~ 1,25 га (~ 110 × ~ 110 м), сплошные линии представляют собой участок 100% обследования 0,64 га (80 × 80 м), треугольники представляют ловушки с наживкой, а звезды представляют 1000 мг MCH. пузыри. Шаг MCH составлял 22,4, 15,8 и 11,2 м для обработок 20, 40 и 80 г MCH га ^-1 соответственно.

Рис. 2.

Диаграммы обработок территорий с использованием МКН для снижения нападения ельников на живую ель. Пунктирные линии представляют блок обработки ~ 1,25 га (~ 110 × ~ 110 м), сплошные линии представляют собой участок 100% обследования 0,64 га (80 × 80 м), треугольники представляют ловушки с наживкой, а звезды представляют 1000 мг MCH. пузыри. Шаг MCH составлял 22,4, 15,8 и 11,2 м для обработок 20, 40 и 80 г MCH га ^-1 соответственно.

Чтобы обеспечить давление жуков-еловых на делянках, были установлены ловушки-воронки с наживкой с фронталином, 1-метил-2-циклогексен-1-олом и смесью терпенов-хозяев (Synergy Semiochemicals Corp) на расстоянии ~ 50 м в пределах двух противоположных углов блока обработки. .Контрольные участки включали две ловушки-воронки с наживкой, но не использовали другие виды обработки. Уловы ловушек собирали каждые 2 недели во время пика полета жуков. Участки на озере Хоупвелл были заложены в конце мая 2016 года, а участки в Биг-Флэт и Милл-Парк — в середине июня 2016 года. В Милл-парке мы наблюдали новые нападения на несколько деревьев в этом районе, что указывает на то, что в этом районе уже начался полёт местных жуков. время установления сюжета.

Измерения участка производились в пределах квадратов 80 × 80 м (0,64 га), центрированных внутри блоков обработки (рис.2) (Gillette et al.2012). В сентябре 2016 г., после полёта жуков, мы провели наземные исследования измеренных блоков для количественной оценки нападений жуков-еловых после обработки. Мы обследовали все живые деревья> 10 см dbh и все ели, которые, по оценкам, были заражены в течение предыдущих 10 лет (деревья, атакованные до 2016 года, были суррогатом размера местной популяции жуков, ковариантой в анализе). Собранные данные включали виды, dbh (измерено с помощью палок Билтмора), статус (живые, массовое нападение на елового жука, атака с полосой, безуспешное нападение или «рассеяние» или другая смертность) и год нападения.Год атаки был определен с использованием символов, описанных Hansen et al. (2006):

1. Атака в текущем году : присутствие бурильной пыли и незрелого расплода, иногда свежих смоляных трубок на дереве с зеленой хвоей;

2. Нападение в прошлом году : симптомы варьируются от увядания игл до выпадения части или большинства игл, живые жуки все еще могут присутствовать, особенно в области корневой шейки;

3. Нападение на второй год : прикреплены тонкие веточки, большая часть или все иглы упали, живого расплода нет;

4. Старое нападение : нет игл, отсутствуют некоторые или многие тонкие веточки.

Индивидуальная защита деревьев

Для испытаний индивидуальной защиты деревьев мы выбрали живую и неповрежденную ель Энгельмана на расстоянии> 50 м от насаждений, используемых для испытаний защиты территорий. Отобранные деревья были размещены с интервалом> 20 м. Все деревья были обработаны фронталином (Synergy Semiochemicals Corp.), чтобы гарантировать, что обработка будет затруднена еловым жуком. Обработки включали: (1) контроль (только приманка), (2) MCH (один пузырек на 1000 мг), (3) AKB (~ 6,8 г активного ингредиента) и (4) MCH плюс AKB.AKB состоит из трех активных ингредиентов: линалоола (47,5% активного ингредиента по весу), β-кариофиллена (42% активного ингредиента) и спиртов листьев, Z3-гексенола (10,5% активного ингредиента). Скорость элюирования для каждого соединения в пакете AKB неизвестна. Репелленты и приманки были прикреплены к северным сторонам штамбов на высоте около 2 м над землей. Каждая обработка была повторена 10 раз в каждой из трех областей, хотя дополнительные наборы приманок и репеллентов позволили нам включить четыре дополнительных дерева, одно контрольное и одно MCH плюс AKB в Mill Park и Big Flat.

Чтобы проверить диаметр дерева в качестве ковариаты, мы выбрали диапазон деревьев с диаметром, начинающимся от 30,5 см. В Милл-парке и озере Хоупвелл мы сгруппировали деревья по классам диаметра каждые 7,6–68,6 см по глубине и случайным образом применили одну из четырех обработок к двум деревьям каждого класса диаметра за обработку. Диаметр деревьев в Биг Флэт, как правило, был больше, где мы использовали классы диаметров каждые 10,2 см до 81,4 см dbh. Дополнительные деревья в Милл-парке и Биг-Флэт были более крупного класса dbh, до 90.2 см на Биг Флэт. Отдельные виды обработок деревьев были исследованы на предмет статуса атаки в сентябре 2016 года.

Анализы

Переменная ответа «status» (только атаки 2016 г.) описывает серьезность атаки и является порядковой, что означает, что категориальные ответы могут быть ранжированы, но с неизвестным расстоянием между классами (0 = не атаковано; 1 = атаковано безуспешно или «подача»; 2 = полосатая атака; 3 = массовая атака). Мы проанализировали данные по площади с помощью модели порядковой логистической регрессии (Hosmer et al.2013). Каждая ель считалась экспериментальной единицей, и результаты модели дают вероятность или вероятность серьезности атаки в зависимости от обработки и любых ковариат. Мы использовали обобщенную линейную смешанную модель с полиномиальным распределением отклика и кумулятивной функцией логит-связи, чтобы учесть «репликацию в пределах области» как случайный эффект (PROC GLIMMIX, SAS Institute, Inc., Кэри, Северная Каролина; Littell et al. 2006). Степени свободы рассчитывались с использованием метода Кенварда – Роджера (Kenward and Roger 1997).Тестируемые ковариаты включали dbh каждой отдельной ели и меры на уровне участка, такие как (1) количество стеблей по годам заражения для ранее зараженной ели, (2) среднее dbh ели> 25 см (Schmid and Frye 1976), (3) ель БА, 4 — общая БА, 5) процент еловой составляющей. Чтобы подсчитать количество стволов ранее зараженной ели, каждое дерево, подвергшееся массовой атаке до 2016 года, засчитывалось как 1,0 убитый ствол, а каждое дерево, подвергшееся полосовой атаке, считалось как 0,5 убитого ствола. Парные сравнения были выполнены с использованием поправки Тьюки – Крамера для значений P и доверительных границ (Kramer 1956).

Мы попытались провести аналогичный анализ для данных отдельного дерева, но в одной обработке все наблюдения были в одном классе статуса, а полное разделение не позволило оценить параметры модели. Вместо этого мы объединили классы статуса, получив в результате два класса: выжившие (не атакованные, безуспешно атакованные и атакованные с раздельной атакой) и подвергшиеся массовой атаке. Это позволило использовать модель биномиального ответа (Allison 2008) и правила, разработанные Shea et al. (1984). Shea et al. использовал аналогичный биномиальный ответ (т.е., убитые вместо выживших) и предположили, что по крайней мере 60% контрольных деревьев необходимо убить, чтобы продемонстрировать «достаточное» давление жуков. Кроме того, они установили проверку нулевой гипотезы о том, что выживаемость деревьев при обработке для защиты деревьев составляла ≥90%, что соответствует стандарту, при котором смертность не превышает 20%. Мы использовали обобщенную линейную смешанную модель для учета «площади» как случайного эффекта (PROC GLIMMIX, SAS Institute, Inc.). Поскольку квази-разделение все еще может быть проблемой, мы подтвердили выводы, используя метод штрафного правдоподобия Ферта (Firth 1993) (PROC LOGISTIC, SAS Institute, Inc.). Результаты были идентичны для обоих типов моделей.

Результаты

Что касается испытаний на защиту территории, условия насаждения перед обработкой были в основном одинаковыми для обработок на каждом из трех участков, за исключением недавно зараженной ели BA в Милл-парке (Таблица 1). Исходные данные (таблица 2) свидетельствовали о значительном лечебном эффекте, подтвержденном статистическим анализом. Ель на контрольных участках с большей вероятностью, в 1,9–2,2 раза, была классифицирована как более сильно пораженная (e.g., подверглись массовым атакам, а не групповым атакам, групповым атакам, а не безуспешным атакам, или неудачным атакам, а не отсутствию атак), чем ель в любом из обработанных MCH обработок ( F _{3, 10024} = 11,62, P <0,0001) (Таблица 3). Ели в трех плотностях развертывания MCH существенно не отличались друг от друга в отношении вероятности более серьезной атаки. Значимые ковариаты представляли собой dbh для каждой ели ( F _{1, 10024} = 128.04, P <0,0001; положительная корреляция) и среднее значение dbh ели на уровне участка ( F _{1, 252,5} = 15,45, P = 0,0001; отрицательная корреляция), плотность ели ( F _{1, 1743} = 7,49, P = 0,0063; отрицательная корреляция) и подсчет ранее зараженных елей, все годы вместе ( F _{1, 10024} = 4,93, P = 0,0265; отрицательная корреляция).

частотности поражения елового жука среди обработок, по площади, в тестах защиты территорий

Таблицы частот пораженности елового жука среди обработок, по площади, в тестах защиты территорий

Отношения шансов на основе модели порядковой логистической регрессии, сравнивающей вероятность того, что ствол ели Энгельмана будет классифицирован с более высокой степенью опасности нападения елового жука (0 = не атаковано; 1 = атаковано неуспешно или «сброшено»; 2 = атаковано полосой; 3 = подверглись массовому нападению) среди экспериментальных пар в пределах мерных делянок 80 × 80 м (0,64 га)

Район (т. основной, а не случайный эффект ( F _{2, 9.8} = 9,44, P = 0,0052). Вероятность более серьезных заражений была значительно выше в Милл-парке и озере Хоупвелл по сравнению с Биг-Флэт, тогда как вероятность более серьезных заражений существенно не различалась между елями в Милл-парке и озере Хоупвелл. Результаты обработки 80 г MCH ha ^–1 в Биг Флэт потенциально были смещены после того, как ловушка в одной повторности была сбита на землю во время пикового периода полета.

Для тестов отдельных деревьев контрольные деревья были значительно более подвержены массовым атакам, чем деревья, обработанные MCH или AKB ( F _{3, 119} = 18.04, P <0,0001), но последние обработки существенно не различались (рис. 3). Деревья, обработанные только MCH или AKB, значительно чаще подвергались массовому нападению, чем деревья, обработанные MCH плюс AKB. Применяя правила Shea et al. (1984), 75% контрольных деревьев подверглись массовому нападению, что указывает на серьезную угрозу со стороны еловых жуков. Хотя деревья, обработанные только MCH или AKB, подвергались меньшему количеству массовых атак, чем контрольные деревья, смертность была слишком высокой (33–37%) для того, чтобы эти обработки считались эффективными с использованием Shea et al.Правила (порог 20%). Однако лечение MCH + AKB не привело к массовым атакам и может считаться эффективным, используя правила Shea et al. (1984). Фактически, ни одно дерево, обработанное MCH + AKB, не подверглось даже безуспешной атаке (разбивка). Диаметр дерева был значимой переменной с положительной корреляцией с вероятностью массового нападения ( F _{1, 119} = 5,61, P = 0,0195) (рис. 4).

Рис. 3.

Подсчет статуса атаки при обработке для индивидуальных тестов защиты деревьев в трех южных районах Скалистых гор.Наибольшее давление жуков было в Милл-парке, а наименьшим — в Биг-Флэт (см. Таблицу 2, количество массовых нападений по районам). Для анализа не атакованные, неудачно атакованные и атакованные деревья были объединены в одну категорию (т.е. «выжили»), чтобы можно было использовать биномиальную логистическую модель.

Рис. 3.

Подсчет статуса атаки при обработке для индивидуальных тестов защиты деревьев в трех южных районах Скалистых гор. Наибольшее давление жуков было в Милл-парке, а наименьшим — в Биг-Флэт (см. Таблицу 2, количество массовых нападений по районам).Для анализа не атакованные, неудачно атакованные и атакованные деревья были объединены в одну категорию (т.е. «выжили»), чтобы можно было использовать биномиальную логистическую модель.

Рис. 4.

Прогнозируемые вероятности гибели еловых жуков в индивидуальных тестах защиты деревьев с использованием репеллентов MCH и AKB в зависимости от диаметра ели (dbh) и обработки в двух районах штата Юта («Mill Park» и «Big Flat ») и один в Нью-Мексико (« Hopewell Lake »).

Рис. 4.

Прогнозируемая вероятность гибели еловых жуков в индивидуальных тестах защиты деревьев с использованием репеллентов MCH и AKB в зависимости от диаметра ели (dbh) и обработки в двух районах штата Юта («Mill Park» и « Big Flat ») и один в Нью-Мексико (« Hopewell Lake »).

Обсуждение

MCH с высоким высвобождением (1000 мг пузырьков с элюированием 12 мг MCH d ^–1 при 25 ° C), развернутый при всех трех плотностях в нашем исследовании защиты территории, значительно снизил вероятность заражения хозяина еловым жуком по сравнению с контрольной обработкой .У ели на контрольных участках была примерно в два раза больше шансов иметь более серьезные уровни поражения по сравнению с елью, обработанной MCH (Таблица 3). Вероятность более серьезных заражений существенно не различалась для трех плотностей MCH (20, 40 и 80 г MCH га ^–1 ). Эффективность MCH оказывается сопоставимой в районах с низким уровнем популяции елового жука (Биг Флэт) и в районах с высоким уровнем популяции елового жука (Милл Парк) (Таблица 2).

Напротив, Hansen et al. (2016) сообщили о ~ 15-кратном снижении вероятности массовых нападений среди ели Энгельмана на участках, обработанных сеткой из MCH (1000 мг пузырьковых крышек) на глубине 16 м (~ 39 г MCH га ^–1 ), окружающих карбарил. -обработанные деревья-ловушки по сравнению с участками с деревьями-ловушками, обработанными карбарилом, но без сетки MCH.Hansen et al. (2016) исследование, проведенное рядом с участками Милл-Парк и Биг-Флэт, включало полухимические вещества изофорон и сулькатон, используемые с каждым пузырьком MCH, и сравнение обоих результатов показывает, что один только MCH имеет ограниченную эффективность в качестве средства защиты территории от нападения еловых жуков. Holsten et al. (2003) снизили частоту атак на участках, обработанных MCH, на 80–87% по сравнению с контрольными участками. В этом исследовании, проведенном с елью Лутца, Picea × lutzii Little, и елью Ситкинской, P . sitchensis (Bong.) Carr., На юге центральной части Аляски, высвобождающее устройство представляло собой микроинфузионный насос, испускающий постоянную дозу MCH независимо от температуры или времени после развертывания. Использование насоса для микроинфузии затрудняет прямое сравнение со скоростью высвобождения MCH, выделяемого пассивным высвобождающим средством (например, 40 г MCH га ^–1 ). Тем не менее, Holsten et al. (2003) развернули насосы для микроинфузии на сетке 9 м (~ 123 га ^–1 на участках 0,2 га), что значительно выше плотности, чем даже наша обработка 80 г MCH га ^–1 .Прямые сравнения с нашими результатами должны учитывать различия в видах хозяев и географические различия в популяциях еловых жуков.

Хотя три протестированных нами плотности MCH существенно не различались по эффективности, мы рекомендуем, чтобы при любом оперативном развертывании использовалась более высокая плотность MCH, например, 40 г MCH га ^–1 . Это мнение было сформировано путем изучения исходных данных (Таблица 2) без учета ковариат, таких как диаметр дерева или характеристики древостоя, которые предполагают, что обработка 20 г MCH га ^–1 имела промежуточную эффективность по сравнению с контролем и более высокую плотность MCH лечения.Развертывание MCH с нормой всего 20 г MCH га ^–1 может эффективно снизить уровень заражения пихты Дугласовой жуком дугласовой пихты, родственным ему жуком-еловым (Ross et al. 1996, 2015), но оперативное развертывание должно позволить предел погрешности для максимизации эффективности лечения (Brookes et al., 2016).

Руководителям необходимо подумать, оправдывает ли снижение вероятности успешного нападения елового жука на ~ 50% затраты на рабочую силу и материалы. Хотя стоимость применения MCH в дозе 40 г на га составляет ~ 10% от стоимости применения инсектицидов, эффективность также значительно ниже, чем при применении инсектицидов.Следует отметить, что наш протокол испытаний включал ловушки-воронки с наживкой, которые нельзя было использовать в зоне, обработанной MCH, и это могло повлиять на эффективность. Это важно, потому что мы наблюдали непропорционально большое количество зараженных в настоящее время деревьев возле ловушек с наживкой независимо от обработки. Следовательно, наши полевые испытания могут не отражать истинную эффективность MCH как средства защиты территории по сравнению со сценарием отсутствия лечения. Тем не менее, объединенные результаты предыдущих исследований (Werner and Holsten 1995, Holsten et al.2003 г., Росс и др. 2004, Hansen et al. 2016), и те, которые здесь представлены, предполагают, что один только MCH является незначительно эффективным в качестве средства защиты территории от елового жука, и что эффективность может быть значительно улучшена путем объединения MCH с другими репеллентными полуохимическими веществами.

И последнее предостережение: частота атак на наших контрольных участках была относительно низкой, даже если она значительно превышала пороговые значения эпидемии, определенные Bentz and Munson (2000) и Hansen et al. (2006). На контрольных участках в Mill Park было 12% елей> 20 см dbh, подвергшихся массовому нападению, по сравнению с 68% на контрольных участках Ross et al.(2004), где MCH существенно не снизил уровень заражения. В других успешных испытаниях MCH против жуков-еловых, исследование Holsten et al. (2003) проводилось на «территории с низкой плотностью популяции еловых насекомых», в то время как Hansen et al. (2016) на контрольных участках в Mill Park В этой области было около 10% массовых атак на ель> 20 см dbh. Поскольку считается, что плотность популяции жуков способствовала предыдущим неудачам MCH против жуков-еловых (Holsten et al. 2003), положительные результаты, которые мы наблюдали, могут быть неповторимы при более высоком давлении жуков.Однако давление популяции было чрезвычайно высоким в неразрезанных насаждениях к югу от наших участков в Милл-парке (напомним, что участки в Милл-парке были частично вырублены примерно в 1960 г., и измененные условия насаждений, возможно, способствовали снижению показателей смертности во время текущей вспышки). Только по данным ADS за 2015 год было оценено около 3650 зараженных елей на площади 672 га в пределах 2 км к югу от наших участков, и большая часть индивидуальных испытаний деревьев в Милл-парке проводилась в этом районе с очень высокой плотностью населения. Наши участки были намеренно размещены в частично вырубленных насаждениях, потому что они были единственными на территории, где в 2016 году все еще были живые восприимчивые ели, а также находились рядом с насаждениями с очень высокой плотностью населения.

Результаты были более убедительными при испытаниях индивидуальной защиты деревьев. Комбинация MCH и AKB привела к полной защите обработанной ели, несмотря на наличие приманки для елового жука. На всех трех исследуемых участках мы не наблюдали ни одного нападения ельника на деревья, обработанные обоими репеллентами (рис. 3). Для сравнения, 75% (24/32) всех контрольных деревьев, содержащих только наживку, подверглись массовой атаке, включая все контрольные деревья в Милл-парке и озере Хоупвелл. Относительно небольшая местная популяция жуков в Биг Флэт (сравните количество массовых нападений в трех местах для испытаний защиты территории в таблице 2) привела к массовым атакам только на 3/11 контрольных деревьев, в то время как еще шесть контрольных деревьев были атакованы с раздеванием.Мы считаем, что общие результаты представляют собой серьезную проблему для обработанных деревьев (Shea et al. 1984) и ожидаем, что обработка MCH плюс AKB будет работать, по крайней мере, так же хорошо в приложениях, которые не включают присутствие приманки для елового жука. Только MCH или AKB имели значительно меньше нападений жуков, чем контрольные деревья, содержащие только наживку, но частота массовых атак превышала порог эффективности лечения Shea et al. (<20%). Тем не менее, разумно ожидать более низких показателей атаки при оперативном использовании, когда обработанные деревья также не подвергаются наживке.Эффективность репеллентов, вероятно, зависела от численности местной популяции елового жука. Большинство деревьев только AKB или MCH остались не атакованными в Биг Флэт, где давление жуков было относительно низким, тогда как большинство деревьев, обработанных только AKB или MCH, подверглись массовому нападению в Милл-парке, где давление жуков было высоким (таблица 2, количество массовых атак; рис. ). Эффективность MCH плюс AKB в качестве единственного средства защиты деревьев может быть снижена в районах с высокой плотностью жуков. С другой стороны, деревья, обработанные MCH плюс AKB, были единственной не пораженной елью, которую мы наблюдали в некоторых частях территории Милл-Парка, что позволяет предположить, что давление местного населения было чрезвычайно высоким.

В биотестах с ловушкой-воронкой с наживкой MCH снижал уловы еловых жуков на ~ 95% при использовании 800–1000 мг MCH, в то время как AKB уменьшал уловы на ~ 80% (неопубликованные данные E. M. Hansen, A. S. Munson, D. Wakarchuk, C. Oehlschlager). Учитывая совокупные результаты этих анализов и настоящего исследования, кажется, что MCH синергизирует с одним или несколькими соединениями AKB для снижения привлекательности елового жука для потенциальных хозяев ниже пороговых значений, необходимых для успешной атаки, даже в присутствии наживки для елового жука.AKB включает три соединения, и неясно, в какой степени любое или все три способствуют репеллентности елового жука, отдельно или в качестве синергиста MCH. Для определения оптимальной смеси компонентов MCH и AKB необходимы дальнейшие испытания. Более того, процесс регистрации EPA можно упростить, если не все три компонента AKB необходимы в оптимизированном репелленте от еловых жуков. Линалоол на терпеноидном спирте зарегистрирован EPA и может использоваться в ароматизированных гигиенических продуктах, таких как мыло и лосьоны.Несмотря на то, что линалоол явно не помечен для использования против жуков-короедов, он использовался в качестве репеллента от комаров, и EPA «определило, что нет никакого воздействия или риска для нецелевых организмов, мест обитания или воды» (EPA 2007). Другие соединения AKB, β-кариофиллен и спирты листьев (Z3-гексенол), могут потребовать регистрации EPA, если они будут сочтены необходимыми как часть оптимизированного репеллента от еловых жуков. MCH уже зарегистрирован EPA и помечен для использования против жуков-еловых и пихт-дугласов.

Планируется дальнейшее тестирование MCH plus AKB для определения оптимальных смесей соединений и количественной оценки эффективности в качестве средства защиты зоны. Мы планируем использовать участки в Юте, Колорадо, Нью-Мексико и на Аляске с эпидемическими популяциями еловых жуков. До тех пор, пока не будут известны эти результаты, а также любая необходимая регистрация продукта, менеджеры ресурсов могут использовать только MCH для снижения вероятности нападения еловых жуков как на отдельные деревья, так и в качестве средства защиты территории. Мы рекомендуем устройства с высоким высвобождением, либо одно устройство на 1000 мг (с элюированием 12 мг MCH d ^–1 ), используемое здесь, либо два или более устройств на 400–500 мг (например.g., два устройства, элюирующие 5 мг d ^–1 , будут эффективно высвобождать 10 мг d ^–1 при развертывании в одной точке). Поскольку один только MCH вряд ли обеспечит полную защиту от популяций еловых жуков, вызывающих строительную эпидемию, менеджеры должны быть готовы обрабатывать деревья, которые заражены, несмотря на обработку (например, санитарные рубки). Ценные ели следует обрабатывать инсектицидами вместо внесения MCH, особенно на участках с эпидемическими популяциями еловых жуков.Будущее семиохимическое развитие, как мы надеемся, приведет к высокой степени репеллентной эффективности там, где не требуется дополнительных обработок. Эта технология наиболее подходит для чувствительных территорий, где методы управления растительностью или применение пестицидов не разрешены, нежелательны или превышают бюджетные ограничения.

Благодарности

Авторы благодарят Давида Вакарчука за технические советы по семиохимическим веществам. Техническую помощь по установке участков и измерениям оказали Аманда Таунсенд, Джим Вандигриф, Валери ДеБландер, Бен Мейерсон и Кори Ларго.Они благодарят Кэти Джонсон и Эндрю Орлеманна (Национальный лес Фишлейк), Кристи Гроувс и Колетт Уэбб (Национальный лес Эшли), а также персонал района Рейнджеров Трес-Пьедрас, Национальный лес Карсон за их сотрудничество. Это исследование финансировалось Лесной службой по оценке воздействия пестицидов и Лесной службой США по охране здоровья лесов. Семиохимикаты были подарены Synergy Semiochemicals Corp.

Цитированные ссылки

Эллисон

П.D

2008

Ошибки сходимости в логистической регрессии

Глобальный форум SAS

360

1

11

Бенц

Б. Дж.

Мансон

A. S

2000

Подавление популяции еловых жуков в северной части штата Юта

Western J. Appl. Для

15

122

128

Брукс

Х. М.

Росс

D. W.

Strand

т. М.

Чертополох

H. W.

Рагенович

I. R.

Лоури

Л. L

2016

Оценка обработок MCH (3-метилциклогекс-2-ен-1-он) с высокой скоростью высвобождения для снижения заражения Dendroctonus pseudotsugae (Coleoptera: Curculionidae)

J. Econ. Энтомол

109

2424

2427

Dyer

E. D. A.

Зал

P. M

1977

Влияние антиагрегативных феромонов 3,2-MCH и транс-вербенола на Dendroctonus rufipennis нападения на пни ели

J. Entomol. Soc. Б. С

74

32

34

Феттиг

С.J.

Hilszczański

Дж

2015

Стратегии управления короедами в хвойных лесах

555

584

F. E.

Вега

Р. З.

Hofstetter

Короеды: биология и экология местных и инвазионных видов

Springer

Лондон

Fettig

C. J.

Клепциг

К. Д.

Биллингс

Р. Ф.

Мансон

A. S.

Небекер

Т. Е.

Негрон

J. F.

Новак

J.T

2007

Эффективность методов управления растительностью для предотвращения и борьбы с заражениями короедами в хвойных лесах на западе и юге США

Forest Ecol. Манаг

238

24

53

Ферт

D

1993

Снижение смещения оценок максимального правдоподобия

Биометрика

80

27

38

Furniss

м. М.

Бейкер

Б. Х.

Хостел

Б.B

1976

Агрегация еловых жуков (Coleoptera) к сеуденолу и подавление притяжения метилциклогексеноном на Аляске

банка. Энтомол

108

1297

1302

Gillette

N. E.

Mehmel

C. J.

Мори

S. R.

Вебстер

Дж.№

Дерево

Д. Л.

Эрбилгин

Н.

Оуэн

D. R

2012

Тактика «толкания-толкай» для смягчения повреждений горных сосновых жуков (Coleoptera: Curculionidae) у сосновых стеблей и белокорых сосен

Environ. Энтомол

41

1575

1586

Хансен

E.М.

Бенц

Б. Дж.

Мансон

A. S.

Вандигриф

J. C.

Тернер

D. L

2006

Оценка воронкообразных ловушек для оценки смертности деревьев и соответствующей фазы популяции елового жука в штате Юта

банка. J. For. Res

36

2574

2584

Hansen

E. M.

Негрон

J. F.

Мансон

A. S.

Анхольд

J. A

2010

Ретроспективная оценка частичной вырубки для снижения смертности еловых жуков в Южных Скалистых горах

Western J. Appl. Для

25

81

87

Hansen

E. M.

Мансон

A. S.

Блэкфорд

Д. С.

Вакарчук

Д.

Баггетт

Л. S

2016

Летальные деревья-ловушки и полуохимические репелленты как стратегии защиты хозяев области для елового жука (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) в штате Юта

J. Econ. Энтомол

109

2137

2144

Holsten

E. H.

их

Р. З.

Мансон

A. S.

Гибсон

К. E

1999

Еловый жук

11

Холстен

E.H.

Ши

P. J.

Борис

Р. R

2003

MCH, выпущенный в новом дозаторе феромонов, предотвращает нападение елового жука Dendroctonus rufipennis (Coleoptera: Scolytidae) в южно-центральной части Аляски

J. Econ. Энтомол

96

31

34

Хосмер

Д.

Лемешоу

с.

Стурдивант

R

2013

Прикладная логистическая регрессия, 3-е изд.

Wiley

Хобокен, Нью-Джерси

Дженкинс

М. Дж.

Хебертсон

E. G.

Мансон

A. S

2014

Биология еловых жуков, экология и менеджмент в Скалистых горах: приложение к еловым жукам в Скалистых горах

Леса

5

21

71

Kenward

M. G.

Роджер

J. H

1997

Вывод небольшой выборки для фиксированных эффектов из ограниченного максимального правдоподобия

Биометрия

53

983

997

Kline

L. N.

Шмитц

р.F.

Рудинский

J. A.

Фурнисс

м. М

1974

Подавление притяжения еловых жуков (Coleoptera) метилциклогексеноном в Айдахо

банка. Энтомол

106

485

491

Kramer

C. Y

1956

Расширение тестов с несколькими диапазонами для группировки средних с неравным числом повторений

Биометрия

12

307

310

Линдгрен

Б. С.

МакГрегор

М. Д.

Дуб

Р. Д.

Мейер

H. E

1989

Подавление нападений еловых жуков МЧН, выпущенным из пузырьковых крышек

Western J. Appl. Для

4

49

52

Littell

R. C.

Милликен

Г. А.

Струп

W. W.

Wolfinger

Р. Д.

Шабенбергер

O

2006

Система SAS для смешанных моделей

Институт SAS, Inc

Кэри, Северная Каролина

Рейнольдс

К.М.

Хольстен

E. H

1994

Относительная значимость факторов риска вспышек еловоедов

Can J. For. Res

24

2089

2095

Росс

D. W.

Валлин

К. F

2008

Дозаторы с высокой скоростью высвобождения 3-метилциклогекс-2-ен-1-он предотвращают заражение жуком пихты Дугласа (Coleoptera: Curculionidae) живой пихты Дугласа

J. Econ. Энтомол

101

1826

1830

Росс

D. W.

Гибсон

К. Е.

их

Р. З.

Мансон

A. S

1996

Оптимальная доза антиагрегационного феромона (3-метилциклогекс-2-ен-1-он) для защиты живой пихты Дугласа от нападения Dendroctonus pseudotsugae (Coleoptera: Scolytidae)

J. Econ. Энтомол

89

1204

1207

Росс

D. W.

Датерман

г. E.

Гибсон

К. E

2002

Скорость элюирования и расстояние между дозаторами антиагрегационных феромонов для защиты живых деревьев от Dendroctonus pseudotsugae (Coleoptera: Scolytidae)

Дж.Экон. Энтомол

95

778

781

Росс

D. W.

Датерман

г. E.

Мансон

A. S

2004

Оценка антиагрегационного феромона, 3-метилциклогекс-2-ен-1-она (MCH), для защиты живой ели от заражения еловым жуком (Coleoptera: Scolytidae) в южной части штата Юта

Дж.Энтомол. Soc. Б. С

101

145

146

Росс

D. W.

Гибсон

К. Е.

Датерман

г. E

2015

Использование MCH для защиты деревьев и насаждений от заражения дугласовым жуком

Группа предприятий по охране здоровья леса, Министерство сельского хозяйства США, Лесная служба

Рудинский

J.A.

Сартвелл

С.

Могилы

т. М.

Морган

M. E

1974

Гранулированный препарат метилциклогексенона: антиагрегантный феромон короедов дугласовой пихты и ели (Col., Scolytidae)

Z. Angew. Энтомол

75

254

263

Самман

С.

Логан

Дж

2000

Оценка и ответные меры на вспышки короеда в районе Скалистых гор: отчет для Конгресса от отдела охраны здоровья лесов, Вашингтонский офис, Лесная служба, USDA

39

Шмид

Дж.М.

Фрай

Р. H

1976

Стенд оценочный для еловых жуков

Fort Collins, Colorado

Shea

P. J.

Хэверти

М. И.

Зал

Р. W

1984

Эффективность фенитротиона и перметрина для защиты сосны пондерозы от нападения соснового жука.

J. Ga. Entomol. Soc

19

427

433

Вернер

Р. А.

Хольстен

E. H

1995

Текущее состояние исследований елового жука, Dendroctonus rufipennis

23

29

С. М.

Салом

К. Р.

Хобсон

Труды собрания Национального энтомологического общества: применение семиохимических веществ для борьбы с заражениями короедов

Виндмюллер-Кампионе

М. А.

Длинный

Дж.№

2015

Если долгосрочная устойчивость к эпидемии елового жука бесполезна, могут ли лесоводственные обработки повысить устойчивость елово-пихтовых лесов в центральной части Скалистых гор?

Леса

6

1157

1178

Заметки автора

Редактор темы: Джон Трамбл

Опубликовано Oxford University Press от имени Энтомологического общества Америки, 2017 г.Эта работа написана (а) государственным служащим (ами) США и находится в общественном достоянии США.

Вададустат, новый пероральный стабилизатор HIF, обеспечивает эффективное лечение анемии при недиализно-зависимой хронической болезни почек

Текущее лечение анемии при хронической болезни почек (ХБП) агентами, стимулирующими эритропоэз, может привести к значительным колебаниям гемоглобина выше целевого диапазона и высоким уровням циркулирующего эритропоэтина. Вададустат (AKB-6548), новый титруемый пероральный ингибитор пролилгидроксилазы, индуцируемый гипоксией, индуцирует синтез эндогенного эритропоэтина и усиливает мобилизацию железа.В этом 20-недельном двойном слепом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании фазы 2b мы оценили эффективность и безопасность вададустата один раз в сутки у пациентов с недиализно-зависимой ХБП со стадиями 3а-5. Первичной конечной точкой был процент пациентов, которые в течение последних 2 недель лечения достигли или поддерживали либо средний уровень гемоглобина 11,0 г / дл или более, либо среднее повышение гемоглобина на 1,2 г / дл или более по сравнению со средним значением до введения дозы. . Примечательно, что первичная конечная точка была достигнута у 54.9% пациентов получали вададустат и 10,3% пациентов получали плацебо. У пациентов, получавших вададустат, по сравнению с плацебо наблюдалось значительное увеличение как ретикулоцитов, так и общей способности связывать железо, а также значительное снижение уровней гепсидина и ферритина в сыворотке. Общая частота нежелательных явлений была сопоставима между двумя группами. Серьезные побочные эффекты произошли у 23,9% и 15,3% пациентов, получавших вададустат и плацебо, соответственно. Три случая смерти произошли в группе вададустата.Таким образом, это исследование фазы 2b продемонстрировало, что вададустат повышает и поддерживает уровни гемоглобина предсказуемым и контролируемым образом, одновременно повышая мобилизацию железа у пациентов с недиализно-зависимой ХБП.

Ключевые слова

анемия

хроническая болезнь почек

эритропоэтин

фактор, индуцируемый гипоксией

пролил-4-гидроксилаза

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Copyright © 2016, International Society of Nephrology.Опубликовано Elsevier Inc.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Приступая к основам

В разработке находятся интересные новые фармацевтические препараты. Вот вкус информации, представленной на встрече Glaucoma 360 на сессии, которую совместно модерируют Лесли Джонс, доктор медицины, заведующий отделением и директор службы глаукомы в больнице Ховардского университета, и Рут Уильямс, доктор медицины, специалист по глаукоме в Глазном институте Уитона. .

Поскольку недавние генетические исследования на мышах и людях определили роль пути ангиопоэтина / Tie2 в развитии и поддержании Шлеммова канала и контроле ВГД, Aerpio Pharmaceuticals выдвинула гипотезу, что восстановление активации Tie2 с помощью местного разупротафиба (AKB-9778) может восстановить канал Шлемма. целостность, улучшение оттока и снижение ВГД и, возможно, прогрессирования открытоугольной глаукомы.

Препарат действует путем ингибирования эндотелиального протеина тирозинфосфатазы сосудов, самого нижнего регулятора пути Tie2, что приводит к восстановлению активации Tie2.

«Мы считаем, что нацеливание на VE-PTP [тирозинфосфатаза эндотелия сосудов] является наиболее эффективным фармакологическим подходом для восстановления активации Tie2», — сказал Кевин Петерс, доктор медицины, главный научный сотрудник и вице-президент по исследованиям и разработкам Aerpio Pharmaceuticals.

Петерс объяснил, что та же функция наблюдается у людей.По его словам, все доклинические и клинические испытания препарата до настоящего времени привели к «значительному» снижению ВГД с хорошей переносимостью. Препарат также снижал ВГД в сочетании с простагландинами стандартного лечения. AKB-9778 — это первый в своем классе активатор Tie2 для лечения первичной открытоугольной глаукомы посредством обычного пути оттока и может использоваться в качестве адъювантной терапии, как потенциальное лекарство для восстановления пути оттока и, возможно, для остановки прогрессирования глаукомы. .

Брайан Мерфи, доктор медицины, главный исполнительный директор Emerald Bioscience, сообщил о работе, проводимой с таргетными терапевтическими средствами на основе синтетических каннабаноидов, в частности с производными каннабаноидов.Пролекарство тетрагидроканнабинола (ТГК), ТГК-валин-гемисукцинат, изучается для снижения ВГД и обеспечения нейрозащиты зрительного нерва; это исследование основано на признании того, что глаз имеет самую высокую плотность каннабиноидных рецепторов в организме (за исключением мозга) на структурах глаза, которые регулируют ВГД.

Мерфи подчеркнул возможный потенциал этого препарата в Азии, где преобладает нормотензивная глаукома. Он пояснил, что на этом рынке большое значение будет иметь препарат, обладающий прямым нейрозащитным действием.

Исследования показали, что наночастицы THC-валин-гемисукцината могут проникать как в передний, так и в задний отделы глаза.

«ТСН-валин-гемисукцинат значительно снизил ВГД по сравнению с тимололом и пилокарпином», — пояснил он, но отметил, что у препарата короткий период полувыведения.

Компания сообщила о результатах модели кролика, которая показала высокую степень биодоступности, при которой лекарство доставлялось в различные ткани глаза. Местные препараты привели к значительному снижению ВГД в этой модели.

Mannin Research разрабатывает 2 новых метода лечения, направленных на механизм действия ангиопоэтина Tie2 для восстановления нормального канала оттока в глазу; «1 — это небольшая молекула, которую вводят один раз в день в виде капель для местного применения (MAN-01), а другая — это инъекционный белковый агонист Tie2 для лечения первичной открытоугольной глаукомы», — отметила Дорис Камар, MBA, директор по развитию бизнеса.

Компания Qamar объявила о партнерстве между Mannin Research и Pendant Biosciences с целью разработки новой рецептуры с расширенным высвобождением для доставки низкомолекулярного биологического препарата MAN-01 для лечения глаукомы.Этот нетоксичный продукт выделяется без взрывов и стабильно в течение длительного периода.

«Это будущее лечения глаукомы», — сказала она.

Камар отметил, что Хизер Шердаун, Бенг, доктор философии, в настоящее время разрабатывает продукт, который будет использоваться с небольшой молекулой, чтобы значительно улучшить биодоступность местных лекарств с целью снижения дозировки, частоты введения и непреднамеренного системного воздействия.

Mannin Research также разрабатывает инструмент для диагностики степени тяжести и прогрессирования глаукомы.Технология потребует отвода водянистой влаги в клинике, первоклассного диагностического теста. Биомаркер проходит клинические испытания. Она объяснила, что сопутствующая диагностика поможет врачам идентифицировать и стратифицировать сегменты населения глаукомы в зависимости от тяжести и прогрессирования заболевания, а также тех, кому лечение, вероятно, принесет пользу.

Продукты Nicox Ophthalmics для лечения глаукомы основаны на исследовательской платформе оксида азота (NO), которая усиливает центральную роль NO в поддержании гомеостаза ВГД в переднем сегменте, сказал Томас Навратил, доктор философии, исполнительный вице-президент, руководитель исследования
и разработка.

Помимо разработки и коммерциализации 0,024% офтальмологического раствора латанопростена бунода (Vyzulta), большая часть усилий компании сейчас сосредоточена
на 2 продуктах клинической стадии, которые явились результатом этого исследования.

NCX 470 — это NO-донорский аналог биматопроста второго поколения, испытание которого началось во втором квартале 2020 года. Второй продукт, NCX 4251, может стать потенциальным средством лечения пациентов с острым блефаритом и синдромом сухих глаз. Ожидается, что NCX 4251 войдет в более крупную фазу 2В клинических испытаний.

В 28-дневном исследовании фазы 2 NCX 470 показал «статистическое превосходство над латанопростом по среднему суточному ВГД и статистическое превосходство по согласованному по времени ВГД в 8, 10 и 16 часов по сравнению с латанопростом. Это важно, поскольку мы используем эту методологию для измерения первичных результатов эффективности в исследованиях фазы 3 », — сказал Навратил.

ВГД снизилось в диапазоне от 7,6 до 9,8 мм рт. Ст., Что он описал как наиболее устойчивое снижение ВГД на величину падения, наблюдаемую в клинических испытаниях.

Дозовая реакция в испытании была захватывающей, так как ВГД линейно увеличивалось и снижалось с каждой последующей дозой препарата; гиперемия достигает максимума при средней дозе, выходит на плато и не увеличивается при высокой дозе (0.065%). Профиль безопасности был хорошим.

Navratil также описал, что 2 продукта исследуются для лечения глаукомы: NO-донорные ингибиторы PDE5, которые нацелены на увеличение первичного оттока из переднего сегмента, которые рассматриваются как терапия первой линии, дополнительная терапия или в комбинации с фиксированной дозой с простагландином. аналог.

Perfuse Therapeutics разрабатывает свои продукты, основываясь на идее, что одного снижения ВГД недостаточно при глаукоме и что кровоток в глазу опосредуется перфузионным давлением и реакцией сосудов на постоянно меняющееся перфузионное давление.